SN/T 1173-2015.Quarantine protocol for avian viral arthritis.
1范围
SN/T 1173规定了鸡及其产品中鸡病毒性关节炎病毒的分离与鉴定、免疫荧光抗体检测反应、实时荧光RT-PCR试验、琼脂凝胶免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验检疫方法的技术规范。
SN/T 1173适用于鸡病毒性关节炎病原学和血清学的检验检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1鸡病毒性关节炎avian viral arthritis ; AVA
一种由禽呼肠孤病毒(Avian reoviridae )引起的鸡的重要传染病。病毒主要侵害关节滑膜、腱鞘和心肌，引起足部关节肿胀,腱鞘发炎,继而使腓肠腱断裂。病鸡关节肿胀、发炎,行动不便,跛行或不愿走动,采食困难,生长停滞。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DEPC:焦碳酸二乙酯( diethypyrocarbonate)
dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)
ELISA:酶联免疫吸附试验( enzyme-linked immunosorbnent assay)
IFA:间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay)
PBS:磷酸盐缓冲液( phosphate buffered saline)
RT-PCR:反转录聚合酶链式反应(reverse transcription PCR)
SPF :无特定病原体( specific pathogen free)

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1173—2015
代替SN/T1173—2003
鸡病毒性关节炎检疫技术规范
Quarantine protocol for avian viral arthritis2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标
鸡病毒性关节炎检疫技术规范
SN/T1173—2015
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷印张1
开本880×12301/16
字数26千字
2016年7月第一版
2016年7月第一次印刷
印数1-1100
书号：155066·2-30288
定价18.00元
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1173一2003《鸡病毒性关节炎抗体检测方法SN/T1173一2003相比，主要技术变化如下：增加了临床诊断方法；
一增加了病原分离鉴定方法；
增加了荧光抗体法检测病原；
增加了鸡病毒性关节炎病毒核酸检测方法；SN/T1173—2015
酶联免疫吸附试验》。本标准与-增加了琼脂扩散试验检测鸡血清中抗鸡病毒性关节炎抗体的方法；修改了酶联免疫吸附试验。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、华南农业大学。
本标准主要起草人：曹琛福、陈兵、林庆燕、卢体康、杨俊兴、秦智锋、贾伟新、花群义、吕建强、叶奕优、曾少灵。
HiiKAoNni KAca
iiKAoNiKAca
1范围
鸡病毒性关节炎检疫技术规范
SN/T1173—2015
本标准规定了鸡及其产品中鸡病毒性关节炎病毒的分离与鉴定、免疫荧光抗体检测反应、实时荧光RT-PCR试验、琼脂凝胶免疫扩散试验和酶联免疫吸附试验检疫方法的技术规范。本标准适用于鸡病毒性关节炎病原学和血清学的检验检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
鸡病毒性关节炎
avian viral arthritis;AVA
一种由禽呼肠孤病毒（Auianreoviridae）引起的鸡的重要传染病。病毒主要侵害关节滑膜、腱鞘和心肌，引起足部关节肿胀，腱鞘发炎，继而使腓肠腱断裂。病鸡关节肿胀、发炎，行动不便，跛行或不愿走动，采食困难，生长停滞。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbnentassay）IFA：间接免疫荧光试验（indirectimmunofluorescenceassay）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscriptionPCR）SPF：无特定病原体（specificpathogenfree）4临床诊断
4.1流行病学
禽呼肠孤病毒主要引起肉鸡发病，偶见蛋鸡和火鸡，可水平传播和垂直传播。鸡病毒性关节炎的感染率和发病率随鸡的年龄越大，敏感性越低，10周龄之后明显降低。1
TiiKAoNi KAca
SN/T1173—2015
4.2临床症状
呼肠孤病毒感染的临床症状和流行方式表现多样化和复杂性。I型（吸收障碍型）潜伏期在自然感染中较难确定。病鸡以体弱，精神不振，羽毛生长不良和腿弱及跛行为特征。1周～3周龄维鸡吸收障碍的症状包括色素沉着不良、羽毛异常、生长不均、骨质疏松、腹泻，粪便中有未消化的伺料，死亡率增加等。发病率为5%～20%，病死率一般为12%～15%。ⅡI型（关节炎/腱鞘炎型）多发于4周7周龄肉鸡，主要症状为关节上方胫骨和腱束双侧肿大，腱移动受限，表现不同程度的跛行继而出现肠肌腱断裂。1d～7d维鸡可见肝炎，心肌炎。病鸡可能在1周～3周内由急性期恢复，但也可能变为慢性。病程稍长时，患肢多向外扭转，步态端研。同时病鸡发育不良，且长期不能恢复。发病率高达100%，但死亡率不及6%。Ⅲ型表现吸收障碍和/或关节炎（腱鞘炎》的临床症状：4.3病理剖检变化
患鸡踏关节周围肿胀，切开皮肤可见关节上部排肠腱水肿.滑膜内常有充血或点状出血，关节腔内含有淡黄色或血样渗出物。根据病程的长短.有时可见周围组织与骨膜脱离。成年鸡容易发生肠腱断裂。慢性病例的关节腔内渗出物较少.腱鞘硬化和粘连·在关节远端关节软骨上出现凹陷的点状溃烂，然后变大、融合，延伸到下方的骨质关节表面纤维软骨膜过度增生。有的切面可见肌和腱交接部发生不全断裂和周围组织粘连，关节腔有脓样、干酪样渗出物4.4病原学及组织学病理变化
参见附录A。
5病料采集与处理
5.1试剂与仪器
青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液。无菌离心管、剪刀、镊子、研钵、高速台式冷冻离心机、涡旋振荡器、冰箱、微量可调移液器等。5.2全血或血清
取疑似病鸡的全血，也可分离血清（将全血室温静置30nnin.3000r/min离心5min，收集上清液，即为血清）。样品应无溶血，无细菌污染。以冷藏状态立即送实验室检疫，不能立即送检的应于4℃保存。
5.3组织或脏器
采集疑似病鸡富含病毒的肝、脾、肿胀的腱鞘、气管和支气管等分别于研钵中充分研磨，再加1倍～2倍磷酸盐缓冲液（含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL）混勾，然后将组织悬液转人无菌1.5mL离心管中5000r/min离心5min，取上清液转人另一无菌1.5mL离心管中，编号，一80℃保存备用。若需采取组织免疫荧光抗体法检测脏器或组织，则直接采集疑似病鸡肝、脾、肿胀的腱鞘等以冷藏状态立即送实验室检疫，不能立即送检的应于一80℃保存。5.4关节腔内渗出物
无菌条件下用剪刀剪开关节腔，用无菌棉拭子沾取关节腔内的渗出物，把棉拭子头放人盛有1.5mL磷酸盐缓冲液（含青毒素2001U/mL，链毒素2001U/mL）中搅匀，盖上管盖并缩号，以冷藏状2
HiiKAoNni KAca
SN/T11732015
态立即送实验室检疫，不能立即送检的应5000r/min离心5min后取上清液一80℃保存。5.5泄殖腔棉拭子
将棉拭子深人泄殖腔转一圈沾取泄殖腔分泌物，把棉拭子头放人盛有1.5mL磷酸盐缓冲液的无菌离心管中（含青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL）混勾，盖上管盖并编号，以冷藏状态立即送实验室检疫，不能立即送检的应5000r/min离心5min后取上清液一80℃保存备用。6病原的分离培养与鉴定
6.1试剂与材料
5%碘酐、70%乙醇，SPF鸡胚、原种鸡胚肾细胞.DMEM液体培养基、石蜡、阳性血清、阴性血清、50%甘油PBS等。
试验用水应符合GB/T6682要求。6.2仪器与设备
照蛋器、铅笔、开孔器、注射器、6号针头、剪刀、镊子、冰箱、细胞培养瓶、孵化箱、COz培养箱等。6.3样品的采集
样品的采集见5.2~5.4。
6.4病毒分离培养与鉴定—鸡胚接种6.4.1鸡胚接种
将5日～7日龄SPF鸡胚用照蛋器照视检查，并用铅笔标记气室和胚胎位置，垂直放置在蛋架上，钝端朝上。用5%碘消毒蛋壳气室后用70%乙醇脱碘消毒。用开孔器在气室中央的蛋壳上钻一小孔，用带有6号针头的1mL注射器将处理好的样品从小孔处沿胚的纵轴迅速刺人约3cm，注人0.2mL～0.5mL待接种的病毒于卵黄囊内，接种后用熔化石蜡封孔，于35C～37C孵化箱内孵育，接种后3d～5d收取死亡鸡胚，可见胚体出血，内脏器官充血或出血。存活胚发育不良，肝、脾、心脏肿大，并含有坏死灶。第5天时将上述活胚℃冷却.无菌收取胚体及尿囊液，可用于传代和鉴定。6.4.2病毒的鉴定
将上述胚体和尿囊液进行荧光RT-PCR试验（见第7章）或琼脂扩散试验（见第8章）来确定是否含有鸡病毒性关节炎病毒。
6.5病毒分离培养与鉴定—细胞培养6.5.1接种培养
将5.2～5.5中制备的样品接种于已培养1d的单层敏感细胞（如鸡胚肾细胞、成纤维细胞、幼仓鼠肾传代细胞），37℃培养箱中培养3d～5d，用0.25%的胰酶消化后收集细胞，转人新培养瓶中传代再培养3d～5d
6.5.2病毒的鉴定——间接免疫荧光抗体反应（IFA）6.5.2.1样品制备与染色
将6.5.1所述感染病变细胞用0.25%的胰酶消化，PBS洗涤3次，用适量PBS悬浮细胞，将细胞悬3
HiiKAoNiKAca
SN/T1173—2015
液滴于玻片上。同时用同批未感染病毒细胞作正常细胞对照。滴加的细胞以细胞铺开、不重叠为宜。室温干燥后，冷丙酮固定10min。PBS漂洗后，充分干燥。将适当稀释的阴性、阳性血清分别滴加于病变细胞片及正常细胞片上，置湿盒内，37℃作用30min～45min，PBS洗涤3次，每次5min，室温干燥，取适当稀释的荧光抗体，滴加于玻片上，置湿盒内，37℃作用30min～45min，PBS洗涤3次，每次5min，50%甘油PBS封片，荧光显微镜下观察。6.5.2.2镜检与结果报告
在阴性、阳性对照血清成立的条件下，即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无荧光；阳性血清与正常细胞反应无荧光，与病毒感染细胞反应有荧光反应，若待检样被感染的细胞内呈现亮绿色荧光，则病毒培养液中含有鸡病毒性关节炎病毒。7实时荧光RT-PCR试验
7.1试剂与材料
RNA提取液（Trizol）、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、实时荧光RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、DNA聚合酶、引物、探针、DEPC水等。7.2仪器与设备
高速台式冷冻离心机，涡旋振荡器，实时荧光PCR仪等。7.3样品采集与处理
见5.2~5.5。
7.4RNA的提取
在样品处理区进行（也可采用其他等效的RNA提取试剂盒）。所有RNA提取器皿用DEPC水浸泡24h，灭菌后方可使用。
取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，并编号。每管加人750μLTrizol，然后分别加人待检样品、阳性对照和阴性对照各250μL，混勾，静置5min，再加人200μL三氯甲烷，混勾，静置5min，于4℃条件下，12000r/min离心15min。取相同数量的1.5mL灭菌离心管，加人500μL异丙醇（一20℃预冷），吸取离心后各管中的上清液转移至相应的新管中，上清液吸取约500L（注意不要吸出白色絮状物），颠倒均勾。于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出离心管，轻轻倒去上清液，加人1mL75%乙醇，颠倒洗涤。
于4℃条件下，12000r/min离心15min。取出离心管，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干每管加人20μL灭菌DEPC水，轻轻混勾，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。
7.5实时荧光RT-PCR反应
7.5.1扩增引物序列及探针序列
采用以下引物扩增病毒S基因中的特异性核苷酸序列：上游引物：5”-CGTTCCCTGTGGACGTATCA-3”；4
HiiKAoNniKAca
下游引I物：5-GAGTACACCCCATACGCTTGGT-3”探针：5'-FAM-CACCCGCGATTCTGCGACTCATG-ECLIPSE-3*7.5.2实时荧光RT-PCR扩增反应体系SN/T1173—2015
实时荧光RT-PCR反应体系为25μL，按表1配制反应体系。也可选用商业的荧光PCR反应预混液。
表1实时荧光RT-PCR反应体系配置表试剂
2Xreal timeRTPCR缓冲液
DNA聚合酶（5U/μL）
反转录酶（5U/μL）
上、下游引物（20μmol/L）
FAM标记的探针（10μmol/L）
DEPC水
7.5.3实时荧光RT-PCR反应程序bzxZ.net
体积/μL
将上述加样好的PCR管放人扩增仪内，记录样本摆放顺序。按以下条件进行扩增：45℃30min；94℃10s60℃45s（收集荧光信号）40个循环：4℃10s。也可参照商业试剂盒说明书进行。检测过程中分别设阳性对照，阴性对照和空白对照。结果判定
在实时荧光RT-PCR反应阳性对照Ct值小于30.0，并有典型扩增曲线：阴性对照和空白对照无Ct值且无扩增曲线，则实验成立。在实验成立情况下，被检样品进行检测时：a）如Ct值35.0，则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录B。b)
如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性。如35.0试剂与材料
磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、叠氮钠、氯化钠和琼脂糖等，均为分析纯鸡病毒性关节炎琼扩抗原，标准阳性血清。平皿或玻璃板、量筒、三角瓶、打孔器、微量移液器和吸头等。8.2
仪器与设备
培养箱、分析天平、冰箱（2℃～8℃)等。5
TiiKAoNniKAca
SN/T1173—2015
8.3样品前处理
按常规方法采血分离血清。样品应无溶血，无细菌污染。保存于4。8.4操作方法
8.4.1制备琼脂板
称取琼脂0.9g，叠氮钠0.1g，用pH7.2,0.01mol/LPBS(配方见附录C)定容至100mL，沸水浴中至充分融化，冷却至60℃～65℃时，将洁净的平血或玻璃板置于平台上，倒人琼脂溶液，使琼脂凝胶厚度约达3mm，待琼脂冷却凝固后，放人湿盒中，4℃冰箱保存备用。8.4.2打孔
在上述制备的琼脂凝胶上，按图1所示打孔.孔径为3mm～4mm，孔距为3mm。用针头轻轻挑出孔中的琼脂，保持孔边完好无损。图1
8.4.3封底
用酒精灯轻烤平血或玻璃板底部，封闭孔的底部，以防侧漏，8.4.4加样
用微量移液器吸取鸡病毒性关节炎琼扩抗原悬液加到\G”孔中.标准阳性血清对照加人“十”孔中，被检血清按照顺序分别加入其余各孔中，每孔均以加满不溢为度8.4.5感作
将平皿加盖保湿，放于37℃温箱内作用24h～72h，分别于24h、48h和72h观察并记录结果。8.5结果判定
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，标准阴性血清与抗原孔之间不出现沉淀线，则试验成立，否则视为无效。阳性结果：被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰的沉淀线，且该线和抗原与标准阳性血清之间沉淀线的未端相吻合。
弱阳性结果：被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性，重复试验，仍为弱阳性者判为阳性。阴性结果：被检血清孔与中心孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性。被检血清孔与中心抗原孔之间的沉淀线粗而混浊或与标准阳性血清孔的沉淀线交叉并直伸，则被检血清孔为非特异性反应，应重做，若仍出现非特异性反应则判为阴性。6
9酶联免疫吸附试验
9.1试剂与材料
包被液、洗涤液、封闭液、底物液、终止液：配方见附录C。SN/T1173—2015
鸡病毒性关节炎ELISA抗原、辣根过氧化物酶标记的抗鸡免疫球蛋白G（IgG-HRP）、阳性参考血清和阴性参考血清。
也可等同采用商业化试剂盒检测。9.2仪器与设备
聚苯乙烯微量反应板，酶标检测仪，温箱，微量移液器，滴头等9.3样品采集
按常规方法采血分离血清。样品应无溶血，无细菌污染。保存于4℃。9.4操作步骤
9.4.1包被
将鸡病毒性关节炎ELISA抗原用包被液稀释到工作浓度，每孔加100μL，置37℃温箱作用1h后再置4℃过夜后备用。
9.4.2洗涤
甩干包被液，每孔加封闭液200μL.置37C温箱封闭90min甩干后用洗涤液洗涤3次，甩干。9.4.3吸附
将待检血清用稀释液作100倍稀释.每孔加100μL.每份血清作两孔，置37℃温箱作用1h，甩干后用洗涤液洗涤5次，甩干。同时加人阳性参考血清和阴性参考血清各两孔。9.4.4加酶标二抗
将抗鸡酶标抗体用稀释液稀释到工作浓度.每孔加100pL.置37℃温箱作用1h，甩干后用洗涤液洗涤5次，甩干。
9.4.5加底物
每孔加新配制的底物溶液100μL，避光37℃反应5min。加终止液
每孔加人2mol/L硫酸溶液50μL，终止反应。9.4.7测定OD值
用酶标仪在波长450nm处测定各孔的OD值，必须在加人终止液后30min内完成。9.5结果判定
当标准阳性血清与标准阴性血清的OD值比值大于2时，试验成立。待检样品的P/N值按式（1)）SN/T1173—2015
计算：
待检血清孔OD值
标准阴性血清OD平均值
·..（1）
P/N≥2为阳性；P/N<1.5为阴性；1.5≤P/N<2时为可疑，重复后仍大于1.5判为阳性。8
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。