SN/T 3304-2012.Quarantine protocol for Babesiosis equine.
1范围
SN/T 3304规定了马巴贝斯虫病的病原学检查、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、微量补体结合试验和聚合酶链式反应方法的技术要求。
SN/T 3304适用于马巴贝斯虫病的血清学调查、诊断和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出人境动物检疫采样
SN/T 1526马巴 贝斯虫病检测方法微量补体结 合试验方法.
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
B. equi, :马巴贝斯虫
EDTA:乙二胺四乙酸
F1TC:异硫氰酸荧光素
4临床诊断
参照附录A的A.1做出初步诊断。
5实验室诊断
5.1血涂片镜检
5.1.1 试剂
5.1.1.1 EDTA溶液(1 mg/mL)(参见附录A)。
5. 1. 1.2 10%的姬姆萨染液(参见附录A)。
5.1.1.3 甲醇(分析纯)。
5.1.2 器械
5.1.2. 1光学显微镜。
5.1.2.2 测微计。
5.1.3 样品的采集
用针头刺破耳静脉采血,滴于载玻片一端。也可采用血球富集法收取红细胞,取一离心管,加人抗凝血6 mL~7mL,充分混合,以2000r/min的速度离心5 min,用吸管吸取上层液体弃掉,注意不要吸掉红细胞层,沉淀即为红细胞,滴于载玻片一端,以备推片。
5.1.4 血涂片制备
将上述样品以常规方法推成血片,干燥后,将少量甲醇滴于血膜上。待甲醇自然干燥后即达固定，然后用10%吉姆萨氏染液染色20min~30min,用水冲净染液,风干,油镜检查,依其形态特征确诊。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3304—2012
马巴贝斯虫病检疫技术规范
Quarantine protocol for Babesiosis equine2012-12-12发布
华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/11.12009给出的规则起草。SN/T3304-—2012
本标准与国际动物卫尘组织（()IE>《诊断试验和疫苗标准手册》（2010)中第2.5.8章一致性程度为非等效，
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归山。本标谁起草单位：中华人民共和国东出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局，中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：鱼海琼，王玉玲、朱米华、罗长保、赵吟、许如苏、林志雄、陈茹、纯见。1范围
马巴贝斯虫病检疫技术规范
SN/T3304—2012
本标谁规定了马巴贝斯出病的病原学检查、间接免疫炭光试验、酶联免疫吸附试验、微量补体结合试验和聚合酶链式反应方法的技术要求。本标准适用于马巴贝斯虫病的血清学调查、诊断和监测。2 规范性引用文件
下列文件对于文件的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
SN/T1526马巴贝斯虫病检测方法微补体结试验方法
3缩略语
下列缩勝语适用于本文件。
B.equi，，马巴贝斯虫
FDTA乙二胺四乙酸
FITC:异硫氰酸荧光素
临床诊断
参照附录A的 A,1做出初步诊断。5实验室诊断
5. 1 血涂片镜检
5.1.1试剂
5. 1. 1. 1 EDTA游液(1 mg/ml,)(参见附录 A)。5,1. 1.2 10%的娅姆萨染液(参见附录 A)。5.1.1.3醇（分析纯）。
5.1.2器械
5.1.2.1光学显微镜。
5. 1.2.2测微计。
SN/T3304-—2012
5.1.3样品的采集
用针头刺破耳静脉采血，滴于载玻片一端。也可采用血球富集法收取红细胞，取一离心管，加人抗凝血6mL～7mL，充分混合，以20cor/min的速度离心5min，用吸管吸取上层液体弃掉，注意不要吸掉红细胞层，沉淀即为红细胞.滴于载玻片一端，以备推片。5.1.4血涂片制备
将上述样品以常规方法推成血片，干燥后，将少量甲醇滴于血膜上。待甲醇自然干燥后即达固定，然后用10%吉姆萨氏染液染色20min30min用水冲净染液，风干，油镜检查.依其形态特征确诊。5.1.5结果判定
马巴贝斯虫镜检为小型虫体，体多位于红细胞内，裂殖子相对较小，长度小于2～3m，呈圆形或阿米巴样，通常4个裂殖子在一起形成四联体或呈“马尔他十字”排列。图片参见A，2。5.2间接免疫荧光抗体试验
5.2.1仪器和设备
磁力搅拌器。
荧光显微镜。
微量移液器。
5.2.2试剂和材料
Puck's SalineG溶液(pH2
配制方法参见附录B
山羊面清。
丙酮。
阴、阳性对照血清。
o.olmol/LpH7.4FBs.配
制方法参见附录B。
FITC荧光素标记的羊抗马
5.2.3操作步骤
抗原片制作
5.2.3.1.1无菌采集感染马巴贝斯虫病动物全血，冷藏方法送至实验室。5.2.3.1.2将装有全血的试管置台式离心机内4℃，2000r/min离心15min.用微量移液器吸弃上清液和白细胞层。
5.2.3.1.3向试管中加入PucksSalineG溶液，用移液器轻柔地欧打沉积的红细胞层，重新悬浮红细胞后，4，2000z/min离心15min，用微量移液器吸弃上清液和白细胞层，依此法重复两次，获得清洗后的红细胞。
5.2.3.1.4用吸管量得红细胞体积，然后加入其两倍体积的含有10%山羊血清的PucksSalineG溶液，重新悬浮红细胞。即如果沉积的血球量为5mL，则应加人含有10%山羊血清的PucksSalineG溶10ml.
5.2.3.1.5取8L的红细胞悬浮液滴在载玻片的一端。再拿另一载玻片，倾斜45°，常规推片，空气晾干，即得抗原片
5.2.3.1.6依此法制备若干抗原片，将若干封好的载玻片用锡箔纸包好，注意不要磨损抗原面，置KAoNiKAca
80℃冰柜中保存备用。
5.2.3.2正式试验
SN/T3304-—2012
5.2.3.2.1依据试验所需从一80℃冰柜中取出若干抗原片，将抗原片放置在带有T燥剂的干燥缸中室温放置约20min。
5.2.3.2.2将一20℃冰箱预冷的内酮倒入染色缸中。将抗原片放进装有丙酮的染色缸中，固定30s。迅速取出抗原片，吹干丙酮。
5.2.3.2.3待抗原片自然干燥后，用一次性注射器取融化的液体蜡或者指甲油等可凝固的材料，将抗原片划成2×5个约1cm的小方块，并置空气中约30min至晾干。5.2.3.2.4在微量反应板中，用含有1%山羊血清的PBS溶液将被检血清、阳性对照血清和阴性对照血清作1：80、1：160、1：320、1：1641：1280稀释
的稀释液滴加到抗原片上相应的小方块中，将其置湿盒中室温下感5.2.3.2.5用微量移液器取10mL
作30min。
5.2.3.2.6用4℃预冷的PBS冲洗玻片后.将其放人囊有4CPBS的烧杯中磁力搅拌洗玻片10min。倒掉液体，重新加入4℃PBS.磁力搅拌洗10m依法重复洗
次。将玻片取出置空气中晾干
5.2.3.2.7用含有1%山羊血清的PBS溶液将荧光素标记的羊抗马IgG作1：80稀释，取10uL稀释液加人到各小方块中，并将其置湿盒中室温下感作30mina
5.2.3.2.8重复5.2.3.2.6。
5.2.3.2.9将干燥好的玻片置荧光显徽镜下观察，5.2.4结果判定
5.2.4.1阳性对照的判定
阳性对照血清的小方块中可见强烈的特异性荧光5.2.4.2阴性对照的判定
阴性对照血清的小方块中未见特舞性荧光。5.2.4.3被检血清的判定
当对照成立时，可进行试验结果判定，当被检血清1：80或更高诺释度的小方块中可见特异性荧光时，则该被检血清判定为间接免疫荧光抗体阳性当被检血清的小方块中未见有特异性荧光时，则该被检血清判定为间接免疫荧光抗体阴性5.3竞争酶联免疫吸附试验
5.3.1试剂
B.equi.抗原
5.3.1.2包被液，见附录C
5.3.1.3封闭液，见附录C
单克隆抗体。
5.3.1.5阴、阳性对照。
辣根过氧化物标记的二抗。
单克降抗体稀释缓冲液。
检测样品稀释缓冲液。
KAONIKAca
SN/T 3304—2012
5.3.1.9浓缩洗液。
5.3.1.10底物液。
5.3. 1. 11 终止液(HS(), 0.5 mol/L) 5.3.2主要仪器
5.3.2.1酶标仪
5.3.2.2培养箱。
5.3.2.3旋涡振荡器。
5.3.3样品的处理
采集马新鲜血液，待血凝后，2500r/min离心10min,无菌分离血清至指形节。5.3.4操作方法
5.3.4.1试剂准备
5.3.4.1.1酶标板包被
用包被液稀释B.egz.纯化抗原，按照优化的浓度，96孔酶标板每孔包被100uL，4过夜。去除包被液，用300uLPBS-T洗涤5次，拍千。每孔加人300uI.封闭液，室温孵育1h：弃掉封闭液，30℃μP13S-T洗涤5次，拍干，现已有或熟试剂盒，口岸检疫中可直接购买经过质量认可和方法确认的包被抗原板或试剂盒。
5.3.4.1.2对照和样品
用样品稀释液将被检血清和对照阴、阳性血清按议定要求的比例稀释，建议预先在血清稀释微量板上稀释样品，对照设置两孔并且加在正式试验板的不同位置，每块板要有对照，提前在记录纸上记录好样品和对照的排布，加样时依据加样记录以免加错。5.3.4.1.3单克隆抗体
将浓缩的单克降抗体按照其倍数稀释。5.3.4.1.4辣根过氧化物酶标记的二抗将浓缩的辣根过氧化物酶标记的二抗按照其倍数橘释。5.3.4.1,5洗液
将浓缩的洗液按照其倍数稀释。5.3.4.2试验程序
5.3.4.2.1加阴、阳性对照和被检血清样品根据样品排列表，用经过校准的适量移液器和相应的吸头移取5GI.阴、阳性对照和被检血消样品至抗原包被板上的相应位置，轻拍板，使对照和样品与抗原包被板板孔底而充分接触，避免太大力，不能使液体溅出或溅人其他孔。室温21C~25℃+孵育30mim。5.3.4.2.2洗板
每孔加人300L稀释好的洗液洗板三次，无自动洗板机时，手洗注意弃去洗液时抓紧板条以免脱4
KAONIKAca
落，快速甩掉洗液后作十净的吸水纸上倒扣板用力拍打四秋，过程中避免板孔干燥，5.3.4.2.3加单克隆抗体
SN/T 3304—2012
每孔加稀释好的加单克降抗体50uL，轻拍板，使其与抗原包被板板孔底面充分接触，避免太大力，不能使液体出或溅人其他孔。室温 21 ℃～25 ℃,孵育 30 min。5.3. 4.2.4洗板
同步骤 5. 3. 4. 2. 2 ,
5.3.4.2.5加辣根过氧化物酶标记的二抗每孔加稀释好的加辣根过氧化物酶标记的二抗50u1.，轻拍板，使其与抗原包被板板孔底面充分接触-避免太大力，不能使液体溅出或溅人其他孔。室温2l℃～2#℃.孵育30 mi1，5.3.4.2.6洗板
同步骤5.3.4.2.2.
5.3.4.2.7加底物
每孔加底物50μl.轻拍板，室湿21℃~25℃，解育15min。注意避光：无需洗板，5.3.4.2.8加终止液
每孔加终止液50μl,轻拍板立即-于酶标仪620ntm、630n或650nm条件下读取OD数值，5. 3. 5 结果判定
5. 3. 5. 1 有效性
5.3.5.1.1阴性对照的（D)平均值（ODVC)大于0.300且小于2.000：即0.30CODNC2.0005.3.5.1.2阳性对照的阻断率240%：阻断率（1%)=100-［（样品（)D×100)（阴性对照平均0D)5.3.5.2结果分析
5.3.5.2.1样品的阻断率大于等于40%判为阳性。5.3.5.2.2样品的阻断率小于40%判为阴性。5.4微量补体结合试验
见SN/T1526
5.5套式聚合酶链式反应
5.5.1 试剂
5.5.1.1T)NA纯化试剂盒：红细胞裂解液、细胞裂解液、蛋白质沉淀液、DNA水化液5.5.1.2蛋白酶K、异丙烷、2%琼脂凝胶、75%乙醇。5.5. I, 3 2 × PCR 反应液:20 nmol/L. Tris-HCI ji含 25LIIag DNA 案合酶、IUUm mol/I. KCl、3 mmol/1, MgCl..0.4 mmol/L dATP,0, 4 mmol/1 dCTP.0, 4 mmul/L dGTP,0. 4 mmol/L dTTP,pH 8.3.
rKAoNiKAca
SN/T3304—2012
2仪器设备
高速台式冷冻离心机。
5.5.2.2 PCR仪。
5.5.2.3电泳槽。
5.5.2.4凝胶成像系统此内容来自标准下载网
样品的采集与前处理
见GB/T18088采样。
5.5.4操作方法
5.5.4.1核酸的提取
5.5.4.1.1取1.5mL的灭菌离心管，对每管进行编5.5.4.1.2取100μL抗凝血加人300μL细胞裂解液，振荡混匀，静置5min，4℃12000r/min离心3min。
5.5.4.1.3
加人50μL蛋白酶K（2m/mL）37
格30ming
5.5.4.1.4加入200μL蛋白质沉定液，轻轻颠倒10次整置2min+℃12000r/min离心2min。15mL灭菌离心管，将上清液转人相应的管中，至少吸取750L，注5.5.4.1.5取与上述数量相同的
意不要吸取中间层，然后加入500预冷的异丙烷.顾倒混匀。512000r/min离心5mn，轻轻倒2
5.5.4.1.6
污染。
5.5.4.1.7加人500L75%乙醇，桌倒洗涤，12上，沾干液体，室温干燥3min。5.5.4.1.8加人20ALDEPC水溶解沉淀以上核酸提取步骤可采用认可和确认的试剂盒，5.5.4.2扩增体系
5.5.4.2.1
液·倒具
吸水纸上沾工液体，注意避免交叉/miin离心
外引物序列为P15-GAGGAOGAGAAACCCAAG-3P2.5内引物序列为P3：5-TCAAGGACAACAAGCCATAC引物浓度100mol/L
5.5.4.2.2套式PCR第一轮反应
PCR反应液
外引物对反应混合液
DNA模板
min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸GCCATCGCCCTTGTAGAG-3
3P45-TTGCCTGGAGCCTTGAAG-3
反应条件：预变性95℃5min：变性95℃20s退火60℃20s延伸72℃20s25个循环：最后延伸72℃5min：保持4℃。
5.5.4.2.3套式PCR第二轮反应
PCR反应液
内引物对混合反应液
KAoNiKAca
第一轮PCR反应物
SN/T3304—2012
反应条件：预变性95℃5min；变性95℃5s，退火60℃5s，延伸72℃5s，25个循环；最后延伸72℃5min；保持4℃。
5.5.4.2.4结果判定
预先灌制1.5%琼脂糖凝胶，然后取5μL二级反应产物进行电泳，电泳时电压为70V.60min凝胶成像系统采集数据
每次检测应设立马巴贝斯虫阳性对照、阴性对照，对照成立方可判定结果。当被检样品在229bp处出现条带判为阳性，参考序列参见附录D，无任何条带出现判为阴性。检疫结果综合判定
涂片镜检发现典型虫体，可确诊补体结合试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验集阳性可确诊
套式聚合酶链式反应阳性则为疑似病例，需要结合其他方法判定结果。S
SN/T3304—2012
A.1临床症状
附录A
（资料性附录）
马巴贝斯虫病的概况及染色液配置马巴贝斯虫病由柔形虫众多种类中的马巴贝斯虫（Babesiaequi.）引起。梨形虫是指顶复门（Api-complexaLevine）架形虫纲（Piroplasmea）梨形虫目（PiroplasmidaWenyon）巴贝斯科（Babesiidae）巴贝斯属（Babesia）及泰勒科（Theileridae）泰勒属（Theileria）中的原虫。梨形虫星形，圆形、杆状或阿米巴样。主要寄生于红细胞，有时也寄生于其他细胞，在脊椎动物宿主体内进行裂殖生殖，在无脊椎动物宿主内进行孢子生殖。传播媒介为硬蝉。发育须以哺乳动物为中间宿主，牌为终未宿主。具有典型的孢子虫三阶段生活史，裂殖生殖在哺乳动物体内进行。其中马巴贝斯虫可引起马巴贝斯虫病。巴贝斯虫的种类也较多，分别感染牛、马、羊、犬等，可造成重大经济损失。牛的巴贝斯虫包括牛巴贝斯虫（B.bouis），双芽巴贝斯虫（B.bigemina）、分歧巴贝斯虫（B.divergens）和卵形巴贝斯虫（B.ovata）。寄生于羊的巴贝斯虫为莫氏巴贝斯虫（B.motasi）。寄生于犬的虫种为犬巴贝斯虫（B.canis）和吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni)·吉氏巴贝斯虫为主要致病虫种。马巴贝斯虫病曾被称为马纳塔焦虫病（Nuttalliasis）或纳氏焦虫病。马巴贝斯虫常与鸯巴贝斯虫混合感染是一种经蜱传播的急性发作的季节性血液原虫病。其特征是马属动物的发热、贫血、黄疽、呼吸困难和血红蛋白尿等。主要寄生于马、驴、骤、斑马的红细胞和淋巴细胞内。
A.2虫体形态
马巴贝斯虫为小型虫体，长度不超过红细胞半径。呈圆形、椭圆形、单架籽形、十字架形等多种形态。以圆形和椭圆形虫体占多数。典型的形状为4个梨籽形虫体以尖端相连成十字架形。镜检虫体依其形态特征如图A，1。
巴贝斯虫参考图片（10×100倍）图A.1
A.31mg/ml.FDTA溶液的配制
SN/T3304—2012
准确称取1.1g二水乙二胺四乙酸二钠（FI)TA-Naz-·2H,0）.加人800)tml.生理盐水中，置55℃～60℃水浴中溶解，冷却后用生理盐水定容至］L.121℃士3℃火菌15min。4吉姆萨染色液配制
吉姆萨粉末1先溶于少量油，在研钵内研磨30）mit以上，至看不见题粒为止，再将全部(66mL)剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。然后再加入4醇（66mL）.搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存，“般刚配制的母液染也效果欠佳，保行时间越长越好，筛用时用pH6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。G
SN/T3304—2012
附录B
（资料性附录）
间接免疫荧光抗体试验溶液配制PucksSalineG溶液（pH7.2)的配制B.1
CaCk.2H.0
MgSO,7H.0
d-葡萄糖
向容器中加人约800mL的GB/T
66s2二级蒸缩水，搅拌至溶液全部溶解后，用1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH调节pH至72加大蒸馏水4℃冰箱中保存备用。
20.01mol/LpH7.4PBS溶液的配制B2
置115℃高压灭菌15min。冷却后向容器中加人10L的蒸馅水搅托
半至溶液全部溶解后，用
mal/L的HCl或1mal/L的NaOH调
节pH至7.2.然后置115℃高
阿氏液的配制
15m，冷却后4℃冰箱中保存备用。向容器中加蒸馏水至100mL，溶解后调pH至6.1后分装，115℃高压灭菌15min，冷却后4℃冰箱中保存备用。
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