SN/T 4525.9-2016
基本信息
标准号： SN/T 4525.9-2016
中文名称：出口食品中致病菌的分子分型MLST 方法第9部分:单核细胞增生李斯特氏菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 出口 食品 致病菌 分子 方法 单核细胞 增生 氏菌
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4525.9-2016.Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 9: Listeria monoc ytogenes.
1范围
SN/T 4525.9规定了出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌分子分型MLST检测方法。
SN/T 4525.9适用于出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的分子分型检测。
2规范性引用 文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。
GB4789.30--2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
GB/T 27403实验室 质量控制规范食 品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1管家基因house-keeping genes
所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因,持家基因
3.1.2
TaqDNA聚合酶Thermus aquaticus DNA poly merase
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。
3.2缩 略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP :脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
MLST:多位点序列分型( multilocus sequence typing)
ST:序列型(Sequence Type)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[ tris( hydroxymethyl) aminomethane]
1范围
SN/T 4525.9规定了出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌分子分型MLST检测方法。
SN/T 4525.9适用于出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌的分子分型检测。
2规范性引用 文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。
GB4789.30--2010食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
GB/T 27403实验室 质量控制规范食 品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1管家基因house-keeping genes
所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因,持家基因
3.1.2
TaqDNA聚合酶Thermus aquaticus DNA poly merase
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。
3.2缩 略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP :脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
MLST:多位点序列分型( multilocus sequence typing)
ST:序列型(Sequence Type)
Tris:三(羟甲基)氨基甲烷[ tris( hydroxymethyl) aminomethane]
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.9—-2016
出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 9:Listeria monocytogenes2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌：
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌；
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌：
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌
第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第9部分，
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4525.9—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、广州市番禺质量技术监督检测所。本部分主要起草人：刘二龙、袁慕云、邓建英、幸芳、许龙岩、吕英姿、将原、薛峰、邵景东、陈碧玲1范围
出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌SN/T4525.9--2016
SN/T4525的本部分规定了出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中单核细胞增生2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.30-2010食品安全国家标准1食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用丁本文件
管家基因house-keepinggenes
所有细胞中均要表达的类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。3.1.2
TaqDNA聚合酶Thermus aquaticus DNA polymerase从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷【tris（hydroxymethyl)aminomethane]4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为47Obp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编1
SN/T4525.9—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性，
试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装，5.1DNA提取液:50mmol/LTris-HCl(pH8.0),100mmol/LEDTA(pH8.0),100mmol/LNaCl,1%SDS
2酚三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）。5.2
5.3异丙醇。
5.475%乙醇
5TE溶液(pH8.0)：10mmol/LTris-HCI(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)，高压灭菌5.5
高保真TaqDVA聚合酶。
dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP.
3引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。5.8
95×PCR缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.4），100mmol/L氯化钾，7.5mmol/L氯化镁。5.9
5.10琼脂糖。
EB核酸染色剂。
分子量标记：100bp2000bpDNAmarker。5×TBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0）。使用时5.13
稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
5.14质控菌株：单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115或等效菌株。6仪器和设备
离心机。
2天平：量程2kg感量0.1g。
3pH计。
6.4涡旋振荡器。
6.5PCR仪。
5电泳仪。
凝胶成像仪。
生物安全柜。
水浴锅。
核酸蛋白分析仪。
基因测序仪
移液器:0.1μl~2.5μl、2μl20μl20μL~200μL100μl~1000μl。7操作流程
多位点序列分子分型的操作流程见图1。2
8检测步骤
8.1细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组DNA
MIL.ST基因选择bzxz.net
PCR引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
图1多位点序列分型（MLST)操作流程SN/T4525.9--2016
将经过GB4789.30—2010的方法鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌的菌株提取其基因组DNA：取增菌培养后的待测菌液1mL，加到1.5ml.离心管中，8000r/min离心3min，弃去上清；加人750μLDNA提取液，65℃温浴30min，加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)500μL，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500μL上清液与400μL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5nin.弃去上清，沉淀十燥后溶于30uLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于-20℃。
注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。8.2DNA浓度和纯度的测定
样品中提取的DNA的纯度和浓度用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定，分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。
DNA的浓度按式（1)计算：
C=AXNX
式中：
-DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；A
-260nm处的吸光值；
核酸稀释倍数。
SN/T4525.9—2016
DVA的纯度按A2u/A28计算，当Ag/Agg比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增8.3MLST基因选择
按表A.1所示，选择单核细胞增生李斯特氏菌的7个管家基因进行MLST分析，8.4PCR扩增引物和测序引物的选择按表A.2合成单核细胞增生李斯特氏菌7个管家基因对应的PCR扩增引物和测序引物。其中对于种系Ⅲ的单核细胞增生李斯特氏菌，在用引物1hk八oF和lhkAoR扩增IhkA基闪失败时，可采用IhkA-F3和lhkA-R2进行扩增；引物稀释为10umol/L工作液备用。8.5管家基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50uL：5XPOR缓冲液10gLdNTP（2.5mmol/L)4μL、l、下游引物（10umol/L）各1L、TaqDNA聚合酶（5U/u0.5模板DNA15μ、水32μL。ahcZ、cat、dapE，dat和ldh基因的反应条件为：98@变性19s.52℃退火12s72℃延伸1min，35个循环，72℃充分延伸10min.4℃保存反应产物。hkA基因的反应条件为：98℃变性10s.52℃退火18s，72℃延伸1min，35个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存反应产物。
变性10，45℃退火1572℃延伸1min.35个循环，72℃充分延bglA基因的反应条件为：98
伸10min，4℃保存反应产物，
注：PCR反应参数和体系可根据不同公司的基因扩增仪和DNA聚合荫进行适当的调整。将PCR产物进行1.5为琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定
8.6DNA序列测定
采用表A.2中的测序引物用基因测序仪对管家基因的DNA序列进行双向测序。也可请有同等能力的公司测序。
8.7结果报告
将单核细胞增生李斯特氏菌菌株的7个管家基因双向测序结果用软件（如DNAstar等）拼接和剪截成标准序列，上传至MIST网站htip：//wwwasteur.fi
/recherche/genopole/PF8/mlsi/Lmono.ht-ml)进行在线数据分析，获得分离菌株等位基因信息，确定分高株的序列型（SeauenceTypeST）。在确定STs的基础上应有MEGA或其他软件对单增李斯特菌菌株进行聚类分析，构建系统遗传进化树（参见附录B）
9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测单核细胞增生李斯特氏菌，所有培养物和废弃物应按照GB19189中的有关规定执行。9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。4
引物类别
扩增引物
附录A
（规范性附录）
SN/T4525.9—2016
单核细胞增生李斯特氏菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
单核细胞增生李斯特氏菌管家基因管家基因序列对应
GeneBank中的登记号
AY158265-AY
158276
AY158286 AY158295
AY158249-AY158264
AY158303-AY158316
AY158277-AY158284
AY160115-AY1601
AY158296-AY158302
管家基因名称
ABC转运蛋白基因（ABCtrRH
sporter)
β饰糖朴酶（hetaglucosidase)过氧化氢酶（catalase）
氨基康琥珀酶（succinyl diaminopimelatedesucci-二牌
rDaininoacidaminotransferaseD氨基酸转氨酶
L-乳酸脱氢酶（L-lactatedehydrogenase）印氨酸激istidinekinase
单核细胞增生李斯特氏菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列引物名称
abeZoF(Forward)
abcZoR(Reverse)
bglAoF(Forward)
bglAoR(Reverse)
catoF(Forward)
catoR(Reverse)
dapEoF(Forward)
dapEoR(Reverse)
daroF(Forward)
datoR(Reverse)
ldhoF(Forward)
IdhoR(Reverse)
lhkAoF(Forward)
lhkAoR(Reverse)
引物序列（5°→+3'）
CTGCTGCCACTTTTATCCA
AGTCACGACGTTGTATCGO
GTTTTCCO
TTGIGAGCGGATAACAATTTCTCAAGGTCGCCGTTTAGAGGTETT
GTTGTAGCCGACTTTTTATGGGGTGGAGCCAGTCACGAC
AATTTCCGATTAAATACGGTGCGGACATAAGCGGATAACA
CCCAGTCACGACGTTGTAATIGGCGCATTTTGATAGAGATGACGATTCCTGCTTTTG
TTGTGAGCGGATAACAATTTCAGATT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACGACTAATGGGCATGAAGAACAAGTTGTGAGCGGATAACAATTTCATCGAACTATGGGCATTTTTACCGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAAAGAGAAGATGCCACAGTTGATTGTGAGCGGATAACAATTTCTGCGTCCATAATACACCATCTTTGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGTATGATTGACATAGATAAAGATTGTGAGCGGATAACAATTTCTATAAATGTCGTTCATACCATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAGAATGCCAACGACGAAACCTTGTGAGCGGATAACAATTTCTGGGAAACATCAGCAATAAAC对于种系Ⅲ的单核细胞增生李斯特氏菌，在用引物lhkAoF和ThkAoR扩增IhkA基因失败时可采用引物IhkA-F3和IhkA-R2
lhkA-F3
ThkA-R2
GCAAGTTTTGAATACGTATCAGCG
TACGCATTTCATGAGAAACATCAG
SN/T4525.9—2016
引物类别
测序引物
引物名称
abcZoF(Forward)
abcZoR(Reverse)
hglAoF(Forward)
bglAoR(Reverse)
catoF(Forward)
catoR(Reverse)
dapEoF(Forward)
dapEoR(Reverse)
datoF(Forward)
datoR(Reverse)
IdhoF(Forward)
IdhoR(Reverse)
lhkAoF(Forward)
lhkAoR(Reverse)
lhkA-F3
lhkA-R2
表A.2（续）
引物序列（5→3°）
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GCAAGTTTTGAATACGTATCAGCG
TACGCATTTCATGAGAAACATCAG
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
SN/T4525.9—2016
将所得到的部分单核细胞增生李斯特氏菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行ML.ST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定单核细胞增生李斯特氏菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用MEGA4或其他相关软件绘制的系统遗传进化树，图B.1为部分单核细胞增生李斯特氏菌进行MLST分析后，应用MEGA4绘制的系统遗传进化树图。FST-98
—ST-155
ST-307
ST-121
ST-101
FST-34
ST-122
ST-343
ST-517
ST-330
ST-218
ST-456
ST-201
部分单核细胞增生季斯特氏菌分离株遗传进化树图
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出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 9:Listeria monocytogenes2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌：
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌；
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌：
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌
第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第9部分，
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4525.9—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、广州市番禺质量技术监督检测所。本部分主要起草人：刘二龙、袁慕云、邓建英、幸芳、许龙岩、吕英姿、将原、薛峰、邵景东、陈碧玲1范围
出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌SN/T4525.9--2016
SN/T4525的本部分规定了出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中单核细胞增生2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.30-2010食品安全国家标准1食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用丁本文件
管家基因house-keepinggenes
所有细胞中均要表达的类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。3.1.2
TaqDNA聚合酶Thermus aquaticus DNA polymerase从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷【tris（hydroxymethyl)aminomethane]4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为47Obp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编1
SN/T4525.9—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性，
试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装，5.1DNA提取液:50mmol/LTris-HCl(pH8.0),100mmol/LEDTA(pH8.0),100mmol/LNaCl,1%SDS
2酚三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）。5.2
5.3异丙醇。
5.475%乙醇
5TE溶液(pH8.0)：10mmol/LTris-HCI(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)，高压灭菌5.5
高保真TaqDVA聚合酶。
dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP.
3引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。5.8
95×PCR缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.4），100mmol/L氯化钾，7.5mmol/L氯化镁。5.9
5.10琼脂糖。
EB核酸染色剂。
分子量标记：100bp2000bpDNAmarker。5×TBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0）。使用时5.13
稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
5.14质控菌株：单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19115或等效菌株。6仪器和设备
离心机。
2天平：量程2kg感量0.1g。
3pH计。
6.4涡旋振荡器。
6.5PCR仪。
5电泳仪。
凝胶成像仪。
生物安全柜。
水浴锅。
核酸蛋白分析仪。
基因测序仪
移液器:0.1μl~2.5μl、2μl20μl20μL~200μL100μl~1000μl。7操作流程
多位点序列分子分型的操作流程见图1。2
8检测步骤
8.1细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组DNA
MIL.ST基因选择bzxz.net
PCR引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
图1多位点序列分型（MLST)操作流程SN/T4525.9--2016
将经过GB4789.30—2010的方法鉴定为单核细胞增生李斯特氏菌的菌株提取其基因组DNA：取增菌培养后的待测菌液1mL，加到1.5ml.离心管中，8000r/min离心3min，弃去上清；加人750μLDNA提取液，65℃温浴30min，加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)500μL，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500μL上清液与400μL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min，75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5nin.弃去上清，沉淀十燥后溶于30uLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于-20℃。
注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。8.2DNA浓度和纯度的测定
样品中提取的DNA的纯度和浓度用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定，分别检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。
DNA的浓度按式（1)计算：
C=AXNX
式中：
-DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；A
-260nm处的吸光值；
核酸稀释倍数。
SN/T4525.9—2016
DVA的纯度按A2u/A28计算，当Ag/Agg比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增8.3MLST基因选择
按表A.1所示，选择单核细胞增生李斯特氏菌的7个管家基因进行MLST分析，8.4PCR扩增引物和测序引物的选择按表A.2合成单核细胞增生李斯特氏菌7个管家基因对应的PCR扩增引物和测序引物。其中对于种系Ⅲ的单核细胞增生李斯特氏菌，在用引物1hk八oF和lhkAoR扩增IhkA基闪失败时，可采用IhkA-F3和lhkA-R2进行扩增；引物稀释为10umol/L工作液备用。8.5管家基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50uL：5XPOR缓冲液10gLdNTP（2.5mmol/L)4μL、l、下游引物（10umol/L）各1L、TaqDNA聚合酶（5U/u0.5模板DNA15μ、水32μL。ahcZ、cat、dapE，dat和ldh基因的反应条件为：98@变性19s.52℃退火12s72℃延伸1min，35个循环，72℃充分延伸10min.4℃保存反应产物。hkA基因的反应条件为：98℃变性10s.52℃退火18s，72℃延伸1min，35个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存反应产物。
变性10，45℃退火1572℃延伸1min.35个循环，72℃充分延bglA基因的反应条件为：98
伸10min，4℃保存反应产物，
注：PCR反应参数和体系可根据不同公司的基因扩增仪和DNA聚合荫进行适当的调整。将PCR产物进行1.5为琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定
8.6DNA序列测定
采用表A.2中的测序引物用基因测序仪对管家基因的DNA序列进行双向测序。也可请有同等能力的公司测序。
8.7结果报告
将单核细胞增生李斯特氏菌菌株的7个管家基因双向测序结果用软件（如DNAstar等）拼接和剪截成标准序列，上传至MIST网站htip：//wwwasteur.fi
/recherche/genopole/PF8/mlsi/Lmono.ht-ml)进行在线数据分析，获得分离菌株等位基因信息，确定分高株的序列型（SeauenceTypeST）。在确定STs的基础上应有MEGA或其他软件对单增李斯特菌菌株进行聚类分析，构建系统遗传进化树（参见附录B）
9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测单核细胞增生李斯特氏菌，所有培养物和废弃物应按照GB19189中的有关规定执行。9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。4
引物类别
扩增引物
附录A
（规范性附录）
SN/T4525.9—2016
单核细胞增生李斯特氏菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
单核细胞增生李斯特氏菌管家基因管家基因序列对应
GeneBank中的登记号
AY158265-AY
158276
AY158286 AY158295
AY158249-AY158264
AY158303-AY158316
AY158277-AY158284
AY160115-AY1601
AY158296-AY158302
管家基因名称
ABC转运蛋白基因（ABCtrRH
sporter)
β饰糖朴酶（hetaglucosidase)过氧化氢酶（catalase）
氨基康琥珀酶（succinyl diaminopimelatedesucci-二牌
rDaininoacidaminotransferaseD氨基酸转氨酶
L-乳酸脱氢酶（L-lactatedehydrogenase）印氨酸激istidinekinase
单核细胞增生李斯特氏菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列引物名称
abeZoF(Forward)
abcZoR(Reverse)
bglAoF(Forward)
bglAoR(Reverse)
catoF(Forward)
catoR(Reverse)
dapEoF(Forward)
dapEoR(Reverse)
daroF(Forward)
datoR(Reverse)
ldhoF(Forward)
IdhoR(Reverse)
lhkAoF(Forward)
lhkAoR(Reverse)
引物序列（5°→+3'）
CTGCTGCCACTTTTATCCA
AGTCACGACGTTGTATCGO
GTTTTCCO
TTGIGAGCGGATAACAATTTCTCAAGGTCGCCGTTTAGAGGTETT
GTTGTAGCCGACTTTTTATGGGGTGGAGCCAGTCACGAC
AATTTCCGATTAAATACGGTGCGGACATAAGCGGATAACA
CCCAGTCACGACGTTGTAATIGGCGCATTTTGATAGAGATGACGATTCCTGCTTTTG
TTGTGAGCGGATAACAATTTCAGATT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTACGACTAATGGGCATGAAGAACAAGTTGTGAGCGGATAACAATTTCATCGAACTATGGGCATTTTTACCGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGAAAGAGAAGATGCCACAGTTGATTGTGAGCGGATAACAATTTCTGCGTCCATAATACACCATCTTTGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAGTATGATTGACATAGATAAAGATTGTGAGCGGATAACAATTTCTATAAATGTCGTTCATACCATGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAGAATGCCAACGACGAAACCTTGTGAGCGGATAACAATTTCTGGGAAACATCAGCAATAAAC对于种系Ⅲ的单核细胞增生李斯特氏菌，在用引物lhkAoF和ThkAoR扩增IhkA基因失败时可采用引物IhkA-F3和IhkA-R2
lhkA-F3
ThkA-R2
GCAAGTTTTGAATACGTATCAGCG
TACGCATTTCATGAGAAACATCAG
SN/T4525.9—2016
引物类别
测序引物
引物名称
abcZoF(Forward)
abcZoR(Reverse)
hglAoF(Forward)
bglAoR(Reverse)
catoF(Forward)
catoR(Reverse)
dapEoF(Forward)
dapEoR(Reverse)
datoF(Forward)
datoR(Reverse)
IdhoF(Forward)
IdhoR(Reverse)
lhkAoF(Forward)
lhkAoR(Reverse)
lhkA-F3
lhkA-R2
表A.2（续）
引物序列（5→3°）
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA
TTGTGAGCGGATAACAATTT
GCAAGTTTTGAATACGTATCAGCG
TACGCATTTCATGAGAAACATCAG
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
SN/T4525.9—2016
将所得到的部分单核细胞增生李斯特氏菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行ML.ST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定单核细胞增生李斯特氏菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用MEGA4或其他相关软件绘制的系统遗传进化树，图B.1为部分单核细胞增生李斯特氏菌进行MLST分析后，应用MEGA4绘制的系统遗传进化树图。FST-98
—ST-155
ST-307
ST-121
ST-101
FST-34
ST-122
ST-343
ST-517
ST-330
ST-218
ST-456
ST-201
部分单核细胞增生季斯特氏菌分离株遗传进化树图
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