SN/T 4418-2016.Detection of Camelus ingredient in export food-Real-time PCR method.
1范围
SN/T 4418规定了食品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，可以对食品中骆驼源性成分进行定性检测,在检测范围和技术指标方面可满足食品的检测需求。
SN/T 4418适用于乳品,新鲜、冷冻和加工的肉品中骆驼源性成分的定性检测。本标准所规定方法的最低检出限(LOD)为0.01%(质量分数):
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403- 2008 实验室 质量控制规范食 品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1骆驼camelus
偶蹄目骆驼科骆驼属,包括单峰骆驼和双峰骆驼
3.1.2实时荧光PCR real time PCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程,实现对起始模板的定量及定性分析。
3.1.3 Ct值 cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonuleic acid)
dNTP :脱氧核苷酸三磷酸( deoxyribonuleoside triphosphate)
CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)
Tris:三羟甲基氨基甲烷[Tris( Hydroxymethy)aminomethane]
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene diaminetetraacetic acid)

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4418-—2016
出口食品中骆驼源性成分的检测实时荧光PCR法
Delection of Camelus ingredient in export food--Real-time PCR method2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
制除屋查真伪
2016-10-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T4418—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、王斌、工婷、刘鸣畅、韩建勋、黄文胜、邓婷婷1范围
出口食品中骆驼源性成分的检测实时荧光PCR法
SN/T4418—2016
本标准规定了食品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，可以对食品中骆驼源性成分进行定性检测，在检测范围和技术指标方面可满足食晶的检测需求本标准适用于乳品，新鲜、冷冻和加工的肉品中骆驼源性成分的定性检测。本标准所规定方法的最低检出限(LOD)为0.01%（质量分数2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是主日期的引用文件，仅注口期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检3术语和定义，缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
骆驼camelus
偶蹄目骆驼科骆驼属，包括单峰骆驼和双峰骆驼3.1.2
实时荧光PCRrealtimePCR
本文件。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析。
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定阅值时所经历的循环数。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷［Tris(Hydroxymethyl)aminomethaneEDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）-TKAONiKAca
SN/T4418—2016
Taq：水生栖热菌（Thermnsaquaticus）OD：光度密度（opticaldensity）Cytb：线粒体细胞色素b基因（cytochromeb）GH：生长激素基因（growthhormonegene）4方法提要
提取DNA，采用骆驼的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR信号，对食品中骆驼成分进行定性检测。5试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
5.1检测用引物和探针：骆驼源性成分扩增引物和探针、内参照引物和探针详见表1，骆驼引物扩增的靶标序列参见附录A。
表1骆驼Cyth基因序列引物探针
物种名称
哺乳动物
(内参照）
引物/探针序列（5°-3）
F.CCTCAGCAGGGTCTTCACCA
R:TTCAGCTTCTCGTAGACNCG
P:FAM-CAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGA-TAMARF:ATTCTTYGCCTTCCAYTTCA
R.AGCGTATGCGAAYAGGAART
P:(FAM)-CCTACACGAAACAGGYTCTAATAACCCGAC-(TAMRA)三氯甲烷（氯仿）。
5.3异丙醇。
扩增片段长度
靶基因
5.4CTAB提取液:20 g/L CTAB,1.4mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCI,0.02 mol/LNa,EDTA,pH8.0
5.5CTAB沉淀液：5g/LCTAB,40mmol/LNaCl.pH8.0。5.6酚-三氯甲烷-异戊醇溶液：按照Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为25：24：1进行配制。
5.7三氯甲烷异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制。5.870%乙醇（体积分数）。
5.9NaCI溶液(1.2mol/L)。
5.10蛋白酶K(20mg/ml）。
5.11实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Tug酶、1XPCRbuffer.2.5mmol/L的Mg2+,0.2UUNG酶0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs,0.2mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）：5.1210XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4).20cmmol/LKCl,15mmol/LMgCl2。3dNTP混合液。
KAONiKAca
6仪器设备
实时荧光PCR仪
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温箱。
离心机：离心力≥16000g。
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微量移液器：0.5μ~10L，10μl100μL20μl~200μl,200μl1000μ。研钵及粉碎装置。
涡旋震荡器。
pH计：精度0.01
离心管：50ml15ml.、2ml.、1.5mlL。6.10
PCR管。
天平：感量0.01mg。
7检测步骤
7.1样品处理方法
将肉制品和奶片等固状待检样品研磨混勾，分装三份，其中一份为检样，另外两份为留存样品。液状样品直接分装
7.2DNA提取
7.2.1肉制品样品
称取100mg肉制品于2ml.离心管中，加人1mLCTAB提取液.加人100μg蛋白酶K，65℃温育1h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加入适量CTAB提取缓冲液；取出后12000g离心10min，转移上清至2mL离心管中，加入等体积的室温酚-三氯甲烷-异戊醇（25*24：1)颠倒混匀，12000g转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，加人等体积的三氯甲烷-异戊醇（24：1），颠倒混勾，室温下12000g离心10min；转移上清至干净离心管中，加入等体积的CTAB沉淀液混勾，室温沉淀1h加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20℃冰箱中预冷的无水乙醇混匀，一20℃放置30min，12000g4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干。加入50μl双蒸水，室温10min，混勾，一20℃保存。7.2.2乳制品样品
量取20mL液态乳于50mL离心管中（乳片称取2g于15mL离心管中），加人等体积的CTAB提取液（乳片加人5mL），加入2mg蛋白酶K（乳片加人500μg）；65℃温育1h，期间不时震荡混勾，取出后12000g离心10min，转移中间层清液至2mL离心管中；加入0.7倍体积的三氯甲烷.充分震荡混匀，室温下12000g离心10min，转移上清至另一灭菌的2mL离心管中，再次加人0.7倍体积的三氯甲烷，充分震荡混匀，室温下12000g离心10min；加人等体积CTAB沉淀液混勺，4℃过夜沉淀，用13000g的转速离心10min；弃上清，加人350μL1.2MNaCI溶液，充分溶解沉淀；加入0.8倍体积的异丙醇或2倍体积-20℃冰箱中预冷的无水乙醇混勺，-20℃放置0.5h～1h，12000g转速下4℃离心10min~15min，弃[清.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g转速下4离心10min，弃上清，室温下晾干。加人50μL双蒸水，溶解沉淀，一20℃保存。3
-TiKAoNiKAca
SN/T4418—2016
上述方法均可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA。注：乳制品DNA提取是针对乳中细胞的DNA进行提取。7.3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A和A0。DVA的浓度按照式（1)计算，当A/A2比值在1.7～2.2之间时，适宜于PCR扩增。=AXNX 50/1000
式中：
DNA浓度，单位为微克每微升（ug/μL）；-260nm处的吸光值：
核酸稀释倍数。
7.4实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系
..（1)
设置阳性对照（骆驼DNA），阴性对照非骆驼的哺乳动物DNA），空白对照。所有样品重复两次见表2。
表2实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应混合液
正向引物（10μmol/L）
反向引物（10μmol
探针(10umol7
DNA模板（5ng）
灭菌ddH.@
实时荧光PCR反应程序
50℃.2min;95℃,10min：40
满环服
质量控制
空白对照：无荧光对数增长，Ct值≥40.0。阴性对照：无荧光对数增长：C1值40.0。C.15s:60
min。
阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤30.0。内参照基因：有荧光对数增长，且荧光道道出现典型的扩增曲线，Ct值≤30.0。结果判断与表述
结果判定
在符合第8章的情况下：
-KAoNKAcaWww.bzxZ.net
样品Ct值≤35，则判定为阳性。样品Ct值≥40，则判定为阴性
SN/T4418—2016
样品35.0Ct值<40.0，则需重复实验。如再次扩增后Ct值仍40.则判定待检样品为阳性；如再次扩增后Ct值≥40，则判定待检样品为阴性。重复样品结果不一致，需要重新扩增。结果表述
样品阳性，表述为“检出骆驼成分”。9.2.1
样品阴性，表述为“未检出骆驼成分”。检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行-iiKAoNiKAca
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双峰驼（GenBank：FJ171713.1）A.1
附录A
（资料性附录）
骆驼源性成分靶标参考序列
ATTCTTTGCCTTCCACTTCATCCTGCCATTTATTATCACGGCCCTAGTAGCCGTACACCTATTATTCCTACACGAAACAGGCTCTAATAACCCGACAGGAATCTCCTCAGACATAGACAAAATCCCATTCCACCCCTACTACACAATTAAAGACATCCTAGGAGCACTGCTACTAATATTAATTCTCCTTATTCTCGTACTGTTCTCACCAGACTTATTAGGAGATCCTGACAACTATACTCCCGCTAACCCCCTCAATACACCACCACACATTAAGCCGGAATGATATTTCCTATTCGCATACGCT
单峰驼（GenBank：AY126630.1）ATTCTTCGCCTTCCATTTCATCCTACCATTCATTATCACGGCTCTAGTGGCCGTACACCTACTATTTCTACACGAAACAGGTTCTAATAACCCAACAGGAATTCCCTCAGACATAGATAAAATCCCATTCCATCCCTATTACACGATTAAAGATATCCTAGGAGCACTACTACTGATGCTAGCCCTACTTATCCTCGTATTATTCTCACCAGACTTATTAGGAGACCCTGACAACTACACTCCCGCCAACCCCCTCAATACACCACCACATATCAAGCCGGAATGATATTTCCTGTTCGCATACGCT
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