SN/T 4656.4-2016
基本信息
标准号： SN/T 4656.4-2016
中文名称：进出口纺织品生物安全检验方法第4部分:金黄色葡萄球菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 进出口 纺织品 生物 安全 检验 方法 金黄色 葡萄球菌
标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 4656.4-2016.Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part 4:Sta phylococcus aureus.
1范围
SN/T 4656.4规定了进出口纺织品中金黄色葡萄球菌的定性.定量检验方法。
SN/T 4656.4适用于进出口纺织品金黄色葡萄球菌的检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
SN/T1538.1培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1538.2培养基制备指南第2.部分:培养基性能测试实用指南
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1纺织品生物安全biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。
3.2金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus
在36 C士1 C条件下,Baird-Parker培养基或血平板培养基.上生长良好,分解甘露醇产酸,血浆凝固酶阳性的革兰氏染色阳性的葡萄状球菌。
4设备与材料
4.1常规微生物检测用的基本设备与材料。
4.2无菌 剪刀。
4.3电子天平:0.01 g。
4.4全滤 网无菌均质袋。
4.5拍击式均质 器:400 mL.
4.6 无菌规格板:20 cm2。
4.7无菌 干燥棉拭子。
4.8恒温培养箱:36℃±1℃
4.9接种环。
4.10显 微镜:10X ~100X.
1范围
SN/T 4656.4规定了进出口纺织品中金黄色葡萄球菌的定性.定量检验方法。
SN/T 4656.4适用于进出口纺织品金黄色葡萄球菌的检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
SN/T1538.1培养基制备指南第1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1538.2培养基制备指南第2.部分:培养基性能测试实用指南
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1纺织品生物安全biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。
3.2金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus
在36 C士1 C条件下,Baird-Parker培养基或血平板培养基.上生长良好,分解甘露醇产酸,血浆凝固酶阳性的革兰氏染色阳性的葡萄状球菌。
4设备与材料
4.1常规微生物检测用的基本设备与材料。
4.2无菌 剪刀。
4.3电子天平:0.01 g。
4.4全滤 网无菌均质袋。
4.5拍击式均质 器:400 mL.
4.6 无菌规格板:20 cm2。
4.7无菌 干燥棉拭子。
4.8恒温培养箱:36℃±1℃
4.9接种环。
4.10显 微镜:10X ~100X.
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4656.4—2016
进出口纺织品生物安全检验方法第4部分：金黄色葡萄球菌
Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part 4:Staphylococcus aureus2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局bZxz.net
2017-07-01实施
SN/T4656《进出口纺织品生物安全检验方法》共分为5部分：第1部分：白假丝酵母菌；
第2部分：大肠埃希氏菌：
第3部分：大肠菌群；
第4部分：金黄色葡萄球菌：
第5部分：菌落总数。
本部分为SN/T4656的第4部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、四川农业大学。SN/T4656.4—2016
本部分主要起草人：李辑、郭会清、郭华麟、韩国全、禹建鹰、苗丽、徐超、乔晴、杨娜。1
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1范围
进出口纺织品生物安全检验方法第4部分：金黄色葡萄球菌
SN/T4656.4—2016
SN/T4656的本部分规定了进出口纺织品中金黄色葡萄球菌的定性、定量检验方法。本部分适用于进出口纺织品金黄色葡萄球菌的检验：其他纺织类产品可参考使用本部分。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
纺织品生物安全
biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.2
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
在36C土1C条件下，Baird-Parker培养基或血平板培养基上生长良好，分解甘露醇产酸，血浆凝固酶阳性的革兰氏染色阳性的葡萄状球菌。设备与材料
4.1常规微生物检测用的基本设备与材料。2无菌剪刀。
电子天平：0.01g。
全滤网无菌均质袋。
拍击式均质器：400mL。
无菌规格板：20cm2。
无菌干燥棉拭子。
3恒温培养箱：36℃士1℃。
接种环。
4.10显微镜：10×~100×。
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SN/T4656.4—2016
无菌试管8mm×100mm。
微量移液器：200~1000μ。
3无菌小三角瓶：25mL。
4.14无菌吸头：1000μL。
5无菌L形玻璃捧。
冰箱：2℃~8℃。
放大镜（放大5倍～10倍）或菌落计数器。5
培养基、试剂
5.1磷酸盐缓冲液：见A.2。
5.2无菌生理盐水：见A.3。
5.3SCDLP培养基：见A.4。
5.4金黄色葡萄球菌显色培养基：见A.5。5.5Baird-Parker培养基：见A.6。5.6营养琼脂平板：见A.7。
5.7普通肉汤培养基：见A.8。
5.8革兰氏染色液：见A.9。
5.9免血浆：见A.10。
5.10金黄色葡萄球菌测试片。
注：本部分中无菌稀释液均为磷酸盐缓冲液（5.1)或无菌生理盐水（5.2）或SCDLP培养基（5.3）6
样品制备
6.1称量法
无菌方法打开用于检测的样品，用无菌剪刀（4.2）均勾剪样，在电子天平（4.3）上准确称取剪下的样品25g样品，剪碎后加人到盛有225mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个1：10的样品匀液。6.2多点采样洗脱法
无菌方法打开送检的样品，在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）按每个采样点20cm2面积范围剪裁，每20平方厘米采样面积为1份检样，每个样品共采集5份检样，采样面积为100cm。将上述采集好的5份检样放人盛有200ml.无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个洗脱液，制成样品勾液作为原液。6.3棉拭子涂抹法
无菌操作方法打开送检的样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（4.7），在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）比照按每个采样点20cm2面积范围均勾涂抹，每个采样点用1个无菌干燥棉拭子（4.7），立即用无菌剪刀（4.2）剪去棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放人盛有50mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，制成1：10的样品匀液。6.4样品制备方法的选择
样品制备一般依6.1方法25g样品十225mL稀释液为基准方法，但当样品为面积较大或较厚实或2
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SN/T4656.4—2016
多孔时，样品制备应采用6.2方法。当出现以下情况时：a）样品质地致密不容易剪碎制备；b)样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用6.3方法。采用6.1、6.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按整数倍递增，直至能有足够的测试样液。采用6.2方法时如果被检样品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。7
金黄色葡萄球菌定性检测
7.1原理
金黄色葡萄球菌具有特定的菌落形态，显微镜下呈革兰阳性葡萄状球菌，血浆凝固酶试验阳性。7.2检验程序
检验程序见图1。
按6.1、6.2、6.3制备的样品加入SCDLP培养基均质36℃±1℃
24h±2h
金黄色葡萄球菌显色培养基和
Baird-Parker培养基
36±1℃
48h±2h
典型或可疑菌落接种营养琼脂平板36±1℃
革兰氏染色镜检
24h±2h
挑取单个菌落接种普通肉汤
36℃±1℃
24h±2h
血浆凝固酶试验
结果报告
图1金黄色葡萄球菌定性检验程序7.3操作步骤
7.3.1增菌
如按6.1制备样品，则称取25g剪碎后加人到盛有225mLSCDLP培养基（5.3）的全滤网无菌均质袋（4.4）中均质：如按6.2制备样品，将采集好的5份检样放人盛有200mLSCDLP培养基（5.3）的全滤网无菌均质袋（4.4）内：如按6.3制备样品，则将棉拭子涂抹部分一块放人盛有50mLSCDLP培养基（5.3）全滤网无菌均质袋（4.4）中，样品制备好后均放人36℃土1℃培养箱（4.8）中增菌培养18h～24h。
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7.3.2分离
用无菌接种环（4.9）将培养后的增菌液接种到金黄色葡葡球菌显色培养基（5.4）平板和BairdParker培养基（5.5）琼脂平板上，36℃土1℃培养48h土2h，观察菌落。金黄色葡萄球菌在显色平板上菌落形态参照其说明书观察：金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基琼脂平板上为圆形.光滑，凸起，湿润.直径为2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其周围有一透明带，用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落.但无混浊带及透明带：如培养48h后两种平板上均无典型或可疑菌落生长，则可直接报告金黄色葡萄球菌未检出。从有典型或可疑菌落的各类平板上至少挑取5个（少于5个全部挑取）典型或可疑单个菌落进行如下确证试验。7.3.3确证试验
7.3.3.1分纯
用无菌接种环（4.9）挑取上述平板上典型或可疑单个菌落接种到营养琼脂平板（5.6）上，36℃土1℃培养24h士2h.分离纯化：将分纯后的菌落接种到普通肉汤培养基（5.7)中，36℃土1℃培养24h±2h。
7.3.3.2镜检
排取营养琼脂平板（5.6）上分纯菌落·涂片.革兰氏染色液（5.8）架色，显微镜（4.10）下观察，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，革兰氏染色为紫色·排列成葡萄状·无芽胞，无夹膜，菌体较小，直径药为0.5μm~1μm。
7.3.3.3血浆凝固酶试验
取0.3mL普通肉汤培养物加人分装好的盛有0.5mL免血浆（5.9）的试管（4.11）内充分混合，置36℃土1℃培养6h，培养结束后将试管倾斜或倒置.如呈现凝块即为凝固，如凝固，则判定为阳性结果。试验中需同时取血浆凝固酶阴性和血浆凝固酶阳性的葡萄球菌菌株做阴性和阳性对照。7.4结果报告
凡在上述选择平板上有典型或可疑苗落生长.经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌，反之报告未检出。8金黄色葡萄球菌定量检测平板计数法8.1原理
样品匀液选取合适的稀释度接种金黄色葡萄球菌显色培养基平板，金黄色葡萄球菌在显色培养基平板上具有特定的菌落形态，再根据金黄色葡萄球菌形态特征和生化特性，鉴定金黄色葡萄球菌。最后按相应公式计算出金黄色葡萄球菌定量结果。一般对金黄色葡萄球菌污染严重的样品检测时选用该方法。
8.2检验程序
检验程序见图2。
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8.3操作步骤
8.3.1样品的稀释
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液10倍系列稀释
选择2个～3个合适稀释度的样品匀液，接种金黄色葡萄球菌显色培养基平板36±C
48h±2h
挑取典型或可疑菌分纯做确证试验验计数证实为金黄色葡萄球菌的菌落结果报告
图2金黄色葡萄球菌平板计数检验程序SN/T4656.4—2016
取微量移液器（4.12），移取样品匀液1mL，缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌小三角瓶（4.13）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇小三角瓶（4.13）或换用1支无菌吸头（4.14）反复吹打使其混合均勾，制成下一稀释度的样品勾液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品勾液。每递增稀释1次，换用1次无菌吸头（4.14）。8.3.2样品接种
检测时应根据样品的实际污染情况，选择2个～3个合适的稀释度样品匀液（包括原液），每个稀释度分别吸取1000μL样品勾液以500μL、500μL的接种量分别接种两个块表面干燥的金黄色葡萄球菌显色培养基（5.4）平板，然后用无菌L形玻璃捧（4.15）均匀涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。将平板正面放置至接种物被培养基吸收，翻转平板，倒置36℃土1℃，培养48h士2h。8.3.3典型或可疑菌落计数
金黄色葡萄球菌在显色平板上菌落形态按其说明书进行判断：挑选有典型或可凝金黄色葡萄球菌菌落，且同一稀释度的两个平板所有典型或可疑菌落数合计在20CFU～200CFU范围内的平板，计数其典型或可疑菌落数。如果：
a）只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落。b）
最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计小于20CFU，计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落。
所有稀释度平板上的菌落数合计均大于200CFU且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度两c
个平板上合计的典型或可疑菌落。5
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以上典型或可疑菌落确证后按式（1）计算式中：
样品中金黄色葡萄球菌菌落数：AB
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k三2：按6.1，6.3制备样品.k=1某一稀释度2个平板典型菌落合计数；某一稀释度确证试验阳性的菌落数；某一试验中用于确证试验的菌落数；稀释因子
两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数合计均在20CFU～200CFU之间，则这两个连续d
稀释度平板上的典型或可疑菌落都应计数；菌落确证后按式(2)计算。A,B/C+AB2X10/C2
式中：
样品中金黄色葡萄球菌菌落数：.（2）
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2：按6.1.6.3制备样品，k=1；第一稀释度（低倍稀释度)2个平板典型或可疑菌落数；第一稀释度（低倍稀释度)确证试验阳性的菌落数；某一试验中第一稀释度（低倍稀释度)用于确证试验的菌落数：第二稀释度（高倍稀释度）2个平板典型或可疑菌落数；第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数；某一试验中第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数；稀释因子（第一稀释度）。
所有稀释度的平板上都没有典型或可疑菌落，则直接以小于1乘以最低稀释倍数报告结果。e)
8.3.4示例
一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见B.1，两个稀释度计数结果都在合适范围内情况参见B.2。
确证试验
从金黄色葡萄球菌显色平板上至少挑取5个（少于5个全部挑取）典型或可疑菌落按7.3.3做确证试验。
8.4结果报告
根据金黄色葡葡球菌显色培养基平板上典型或可疑菌落总数，按照8.3.3中公式计算，报告每平方厘米每克或每100平方厘米样品金黄色葡萄球菌数，以CFU/cm，CFU/g或CFU/100cm表示。如T值为O.则以小于1乘以最低稀释倍数报告：如T值小于100CFU，以实际数值报告：如T值大于或等于100CFU时，报告时数值按GB/T8170规则进行修约，用10的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。
9金黄色葡萄球菌定量检测方法
测试片法
9.1原理
金黄色葡萄球菌测试片是一种能快速检测金黄色葡萄球菌的测试纸片，它含有经改良的Baird6
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Parker培养基，具有很强的选择功能和显色功能，根据金黄色葡萄球菌在测试片上呈特有的菌落形态对其定量计数。一般对金黄色葡萄球菌污染严重的样品检测时选用该方法。9.2检验程序
检验程序见图3。
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液中
10倍系列稀释
选择2个～3个连续的适宜稀释度的样品匀减，接种金黄色葡萄球菌测试片
36℃±℃
无菌落生长
48h±2h
特有菌落形态
直接计数菌落
报告结果
图3金黄色葡萄球菌测试片法检验程序9.3
操作步骤
样品的稀释
同8.3.1。
9.3.2样品接种
从冰箱（4.16）中取出金黄色葡萄球菌测试片（5.10）室温下放置10min。接种时将测试片置于水平操作台上。选择适宜的2个～3个连续稀释度的样品匀液，掀起测试片上层膜，用微量移液器（4.12）吸取1mL样液垂直接种于测试片中央，每个稀释度接种2片，每片500μL。轻轻将上层膜放下覆盖在接种面上，避免气泡产生。用配套压板轻轻的对测试片中心施压，使测试样液均匀地分布于圆形的含培养基的生长区域内。接种后将测试片室温静置至少1min，以使凝胶固化。具体操作按测试片说明书进行。
9.3.3培养
将测试片的透明面朝上，堆叠片数不超过20片，水平置于培养箱（4.8）内，36℃土1℃条件下培养48h±2h。
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4典型菌落计数
9.4.1判读
根据测试片判读说明书，直接计数特有菌落形态的金黄色葡萄球菌。9.4.2菌落计数
培养结束后应及时计数，可目视或使用放大镜（放大5倍～10倍）或菌落计数器（4.17）辅助计数。计数规则参照8.3.3
5计算结果
计算结果参照8.3.3。
6结果报告
根据金黄色葡萄球菌测试片上典型特征菌落总数，按照8.3.3计算后报告结果，结果报告参照8.4。8
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进出口纺织品生物安全检验方法第4部分：金黄色葡萄球菌
Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part 4:Staphylococcus aureus2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局bZxz.net
2017-07-01实施
SN/T4656《进出口纺织品生物安全检验方法》共分为5部分：第1部分：白假丝酵母菌；
第2部分：大肠埃希氏菌：
第3部分：大肠菌群；
第4部分：金黄色葡萄球菌：
第5部分：菌落总数。
本部分为SN/T4656的第4部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、四川农业大学。SN/T4656.4—2016
本部分主要起草人：李辑、郭会清、郭华麟、韩国全、禹建鹰、苗丽、徐超、乔晴、杨娜。1
Hii KAoNi KAca
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1范围
进出口纺织品生物安全检验方法第4部分：金黄色葡萄球菌
SN/T4656.4—2016
SN/T4656的本部分规定了进出口纺织品中金黄色葡萄球菌的定性、定量检验方法。本部分适用于进出口纺织品金黄色葡萄球菌的检验：其他纺织类产品可参考使用本部分。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
纺织品生物安全
biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.2
金黄色葡萄球菌
Staphylococcus aureus
在36C土1C条件下，Baird-Parker培养基或血平板培养基上生长良好，分解甘露醇产酸，血浆凝固酶阳性的革兰氏染色阳性的葡萄状球菌。设备与材料
4.1常规微生物检测用的基本设备与材料。2无菌剪刀。
电子天平：0.01g。
全滤网无菌均质袋。
拍击式均质器：400mL。
无菌规格板：20cm2。
无菌干燥棉拭子。
3恒温培养箱：36℃士1℃。
接种环。
4.10显微镜：10×~100×。
HiiKAoNiKAca
SN/T4656.4—2016
无菌试管8mm×100mm。
微量移液器：200~1000μ。
3无菌小三角瓶：25mL。
4.14无菌吸头：1000μL。
5无菌L形玻璃捧。
冰箱：2℃~8℃。
放大镜（放大5倍～10倍）或菌落计数器。5
培养基、试剂
5.1磷酸盐缓冲液：见A.2。
5.2无菌生理盐水：见A.3。
5.3SCDLP培养基：见A.4。
5.4金黄色葡萄球菌显色培养基：见A.5。5.5Baird-Parker培养基：见A.6。5.6营养琼脂平板：见A.7。
5.7普通肉汤培养基：见A.8。
5.8革兰氏染色液：见A.9。
5.9免血浆：见A.10。
5.10金黄色葡萄球菌测试片。
注：本部分中无菌稀释液均为磷酸盐缓冲液（5.1)或无菌生理盐水（5.2）或SCDLP培养基（5.3）6
样品制备
6.1称量法
无菌方法打开用于检测的样品，用无菌剪刀（4.2）均勾剪样，在电子天平（4.3）上准确称取剪下的样品25g样品，剪碎后加人到盛有225mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个1：10的样品匀液。6.2多点采样洗脱法
无菌方法打开送检的样品，在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）按每个采样点20cm2面积范围剪裁，每20平方厘米采样面积为1份检样，每个样品共采集5份检样，采样面积为100cm。将上述采集好的5份检样放人盛有200ml.无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个洗脱液，制成样品勾液作为原液。6.3棉拭子涂抹法
无菌操作方法打开送检的样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（4.7），在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）比照按每个采样点20cm2面积范围均勾涂抹，每个采样点用1个无菌干燥棉拭子（4.7），立即用无菌剪刀（4.2）剪去棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放人盛有50mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，制成1：10的样品匀液。6.4样品制备方法的选择
样品制备一般依6.1方法25g样品十225mL稀释液为基准方法，但当样品为面积较大或较厚实或2
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多孔时，样品制备应采用6.2方法。当出现以下情况时：a）样品质地致密不容易剪碎制备；b)样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用6.3方法。采用6.1、6.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，稀释液量可按整数倍递增，直至能有足够的测试样液。采用6.2方法时如果被检样品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。7
金黄色葡萄球菌定性检测
7.1原理
金黄色葡萄球菌具有特定的菌落形态，显微镜下呈革兰阳性葡萄状球菌，血浆凝固酶试验阳性。7.2检验程序
检验程序见图1。
按6.1、6.2、6.3制备的样品加入SCDLP培养基均质36℃±1℃
24h±2h
金黄色葡萄球菌显色培养基和
Baird-Parker培养基
36±1℃
48h±2h
典型或可疑菌落接种营养琼脂平板36±1℃
革兰氏染色镜检
24h±2h
挑取单个菌落接种普通肉汤
36℃±1℃
24h±2h
血浆凝固酶试验
结果报告
图1金黄色葡萄球菌定性检验程序7.3操作步骤
7.3.1增菌
如按6.1制备样品，则称取25g剪碎后加人到盛有225mLSCDLP培养基（5.3）的全滤网无菌均质袋（4.4）中均质：如按6.2制备样品，将采集好的5份检样放人盛有200mLSCDLP培养基（5.3）的全滤网无菌均质袋（4.4）内：如按6.3制备样品，则将棉拭子涂抹部分一块放人盛有50mLSCDLP培养基（5.3）全滤网无菌均质袋（4.4）中，样品制备好后均放人36℃土1℃培养箱（4.8）中增菌培养18h～24h。
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7.3.2分离
用无菌接种环（4.9）将培养后的增菌液接种到金黄色葡葡球菌显色培养基（5.4）平板和BairdParker培养基（5.5）琼脂平板上，36℃土1℃培养48h土2h，观察菌落。金黄色葡萄球菌在显色平板上菌落形态参照其说明书观察：金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基琼脂平板上为圆形.光滑，凸起，湿润.直径为2mm3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其周围有一透明带，用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落.但无混浊带及透明带：如培养48h后两种平板上均无典型或可疑菌落生长，则可直接报告金黄色葡萄球菌未检出。从有典型或可疑菌落的各类平板上至少挑取5个（少于5个全部挑取）典型或可疑单个菌落进行如下确证试验。7.3.3确证试验
7.3.3.1分纯
用无菌接种环（4.9）挑取上述平板上典型或可疑单个菌落接种到营养琼脂平板（5.6）上，36℃土1℃培养24h士2h.分离纯化：将分纯后的菌落接种到普通肉汤培养基（5.7)中，36℃土1℃培养24h±2h。
7.3.3.2镜检
排取营养琼脂平板（5.6）上分纯菌落·涂片.革兰氏染色液（5.8）架色，显微镜（4.10）下观察，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，革兰氏染色为紫色·排列成葡萄状·无芽胞，无夹膜，菌体较小，直径药为0.5μm~1μm。
7.3.3.3血浆凝固酶试验
取0.3mL普通肉汤培养物加人分装好的盛有0.5mL免血浆（5.9）的试管（4.11）内充分混合，置36℃土1℃培养6h，培养结束后将试管倾斜或倒置.如呈现凝块即为凝固，如凝固，则判定为阳性结果。试验中需同时取血浆凝固酶阴性和血浆凝固酶阳性的葡萄球菌菌株做阴性和阳性对照。7.4结果报告
凡在上述选择平板上有典型或可疑苗落生长.经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌，反之报告未检出。8金黄色葡萄球菌定量检测平板计数法8.1原理
样品匀液选取合适的稀释度接种金黄色葡萄球菌显色培养基平板，金黄色葡萄球菌在显色培养基平板上具有特定的菌落形态，再根据金黄色葡萄球菌形态特征和生化特性，鉴定金黄色葡萄球菌。最后按相应公式计算出金黄色葡萄球菌定量结果。一般对金黄色葡萄球菌污染严重的样品检测时选用该方法。
8.2检验程序
检验程序见图2。
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8.3操作步骤
8.3.1样品的稀释
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液10倍系列稀释
选择2个～3个合适稀释度的样品匀液，接种金黄色葡萄球菌显色培养基平板36±C
48h±2h
挑取典型或可疑菌分纯做确证试验验计数证实为金黄色葡萄球菌的菌落结果报告
图2金黄色葡萄球菌平板计数检验程序SN/T4656.4—2016
取微量移液器（4.12），移取样品匀液1mL，缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌小三角瓶（4.13）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇小三角瓶（4.13）或换用1支无菌吸头（4.14）反复吹打使其混合均勾，制成下一稀释度的样品勾液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品勾液。每递增稀释1次，换用1次无菌吸头（4.14）。8.3.2样品接种
检测时应根据样品的实际污染情况，选择2个～3个合适的稀释度样品匀液（包括原液），每个稀释度分别吸取1000μL样品勾液以500μL、500μL的接种量分别接种两个块表面干燥的金黄色葡萄球菌显色培养基（5.4）平板，然后用无菌L形玻璃捧（4.15）均匀涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。将平板正面放置至接种物被培养基吸收，翻转平板，倒置36℃土1℃，培养48h士2h。8.3.3典型或可疑菌落计数
金黄色葡萄球菌在显色平板上菌落形态按其说明书进行判断：挑选有典型或可凝金黄色葡萄球菌菌落，且同一稀释度的两个平板所有典型或可疑菌落数合计在20CFU～200CFU范围内的平板，计数其典型或可疑菌落数。如果：
a）只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落。b）
最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数合计小于20CFU，计数该稀释度两个平板上合计的典型或可疑菌落。
所有稀释度平板上的菌落数合计均大于200CFU且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度两c
个平板上合计的典型或可疑菌落。5
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以上典型或可疑菌落确证后按式（1）计算式中：
样品中金黄色葡萄球菌菌落数：AB
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k三2：按6.1，6.3制备样品.k=1某一稀释度2个平板典型菌落合计数；某一稀释度确证试验阳性的菌落数；某一试验中用于确证试验的菌落数；稀释因子
两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数合计均在20CFU～200CFU之间，则这两个连续d
稀释度平板上的典型或可疑菌落都应计数；菌落确证后按式(2)计算。A,B/C+AB2X10/C2
式中：
样品中金黄色葡萄球菌菌落数：.（2）
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2：按6.1.6.3制备样品，k=1；第一稀释度（低倍稀释度)2个平板典型或可疑菌落数；第一稀释度（低倍稀释度)确证试验阳性的菌落数；某一试验中第一稀释度（低倍稀释度)用于确证试验的菌落数：第二稀释度（高倍稀释度）2个平板典型或可疑菌落数；第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数；某一试验中第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数；稀释因子（第一稀释度）。
所有稀释度的平板上都没有典型或可疑菌落，则直接以小于1乘以最低稀释倍数报告结果。e)
8.3.4示例
一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见B.1，两个稀释度计数结果都在合适范围内情况参见B.2。
确证试验
从金黄色葡萄球菌显色平板上至少挑取5个（少于5个全部挑取）典型或可疑菌落按7.3.3做确证试验。
8.4结果报告
根据金黄色葡葡球菌显色培养基平板上典型或可疑菌落总数，按照8.3.3中公式计算，报告每平方厘米每克或每100平方厘米样品金黄色葡萄球菌数，以CFU/cm，CFU/g或CFU/100cm表示。如T值为O.则以小于1乘以最低稀释倍数报告：如T值小于100CFU，以实际数值报告：如T值大于或等于100CFU时，报告时数值按GB/T8170规则进行修约，用10的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。
9金黄色葡萄球菌定量检测方法
测试片法
9.1原理
金黄色葡萄球菌测试片是一种能快速检测金黄色葡萄球菌的测试纸片，它含有经改良的Baird6
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Parker培养基，具有很强的选择功能和显色功能，根据金黄色葡萄球菌在测试片上呈特有的菌落形态对其定量计数。一般对金黄色葡萄球菌污染严重的样品检测时选用该方法。9.2检验程序
检验程序见图3。
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液中
10倍系列稀释
选择2个～3个连续的适宜稀释度的样品匀减，接种金黄色葡萄球菌测试片
36℃±℃
无菌落生长
48h±2h
特有菌落形态
直接计数菌落
报告结果
图3金黄色葡萄球菌测试片法检验程序9.3
操作步骤
样品的稀释
同8.3.1。
9.3.2样品接种
从冰箱（4.16）中取出金黄色葡萄球菌测试片（5.10）室温下放置10min。接种时将测试片置于水平操作台上。选择适宜的2个～3个连续稀释度的样品匀液，掀起测试片上层膜，用微量移液器（4.12）吸取1mL样液垂直接种于测试片中央，每个稀释度接种2片，每片500μL。轻轻将上层膜放下覆盖在接种面上，避免气泡产生。用配套压板轻轻的对测试片中心施压，使测试样液均匀地分布于圆形的含培养基的生长区域内。接种后将测试片室温静置至少1min，以使凝胶固化。具体操作按测试片说明书进行。
9.3.3培养
将测试片的透明面朝上，堆叠片数不超过20片，水平置于培养箱（4.8）内，36℃土1℃条件下培养48h±2h。
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4典型菌落计数
9.4.1判读
根据测试片判读说明书，直接计数特有菌落形态的金黄色葡萄球菌。9.4.2菌落计数
培养结束后应及时计数，可目视或使用放大镜（放大5倍～10倍）或菌落计数器（4.17）辅助计数。计数规则参照8.3.3
5计算结果
计算结果参照8.3.3。
6结果报告
根据金黄色葡萄球菌测试片上典型特征菌落总数，按照8.3.3计算后报告结果，结果报告参照8.4。8
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