SN/T 4656.2-2016
基本信息
标准号： SN/T 4656.2-2016
中文名称：进出口纺织品生物安全检验方法第2部分:大肠埃希氏菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 进出口 纺织品 生物 安全 检验 方法 大肠 埃希氏
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4656.2-2016.Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part 2 :Escherichia coli.
1范围
SN/T 4656.2规定了进出口纺织品中大肠埃希氏菌的定量检验方法。
SN/T 4656.2适用于进出口纺织品大肠埃希氏菌定量检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.
GB/T 8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
SN/T 1538.1培养基制备指南 第 1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1538.2培养基制备指南第2部分:培养基性能测试实用指南
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1纺织品生物安全biosafety of texiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁,及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。
3.2大肠埃希氏菌Escherichia coli
通称大肠杆菌,是埃希氏菌属的代表菌,广泛存在于人和温血动物的肠道中,是人类和动物肠道中的正常菌群,在一定条件下可引起肠道外感染.某些血清型菌株的致病性强,引起腹泻,能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气,IMViC(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)生化试验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。
4设备与材料
4.1常规微生物检测用的基本设备与材料。
4.2无菌剪刀 、镊子。
4.3电子天平:0.01 g.
4.4 全滤网无菌均质袋。
4.5拍击式均质 器:400 ml.
1范围
SN/T 4656.2规定了进出口纺织品中大肠埃希氏菌的定量检验方法。
SN/T 4656.2适用于进出口纺织品大肠埃希氏菌定量检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.
GB/T 8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
SN/T 1538.1培养基制备指南 第 1部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1538.2培养基制备指南第2部分:培养基性能测试实用指南
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1纺织品生物安全biosafety of texiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁,及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。
3.2大肠埃希氏菌Escherichia coli
通称大肠杆菌,是埃希氏菌属的代表菌,广泛存在于人和温血动物的肠道中,是人类和动物肠道中的正常菌群,在一定条件下可引起肠道外感染.某些血清型菌株的致病性强,引起腹泻,能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气,IMViC(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐)生化试验为++--或-+--的革兰氏阴性杆菌。
4设备与材料
4.1常规微生物检测用的基本设备与材料。
4.2无菌剪刀 、镊子。
4.3电子天平:0.01 g.
4.4 全滤网无菌均质袋。
4.5拍击式均质 器:400 ml.
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4656.2—2016
进出口纺织品生物安全检验方法第2部分：大肠埃希氏菌
Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part2Escherichiacoli
2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T4656《进出口纺织品生物安全检验方法》共分为5部分：第1部分：白假丝酵母菌；
一第2部分：大肠埃希氏菌；
-第3部分：大肠菌群；
第4部分：金黄色葡萄球菌；
第5部分：菌落总数。
本部分为SN/T4656的第2部分。
本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4656.2—2016
本部分起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、江西省人民医院、四川农业大学。本部分主要起草人：郭会清、李、曹乾、郭华麟、禹建鹰、苗丽、杨娜、徐超、乔晴、王永杰。1
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1范围
进出口纺织品生物安全检验方法第2部分：大肠埃希氏菌
SN/T4656的本部分规定了进出口纺织品中大肠埃希氏菌的定量检验方法。SN/T4656.2—2016
本部分适用于进出口纺织品大肠埃希氏菌定量检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
纺织品生物安全biosafetyof textiles纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.2
大肠埃希氏菌Escherichiacoli
通称大肠杆菌，是埃希氏菌属的代表菌，广泛存在于人和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中的正常菌群，在一定条件下可引起肠道外感染，某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为十十一一或一十一一的革兰氏阴性杆菌。
4设备与材料
常规微生物检测用的基本设备与材料。4.2
无菌剪刀、镊子。
4.3电子天平：0.01g。
4.4全滤网无菌均质袋
拍击式均质器：400mLc
4.6无菌规格板：20cm2。
无菌干燥棉拭子。
微量移液器：200μL~1000μL1mL10mL。4.9无菌小三角瓶：25mL。
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SN/T4656.2—2016
无菌吸头：1000吨L，10mL。
无菌玻璃平皿或塑料平Ⅲ：15mm×90mm。恒温水浴箱：45℃土1℃。
恒温培养箱：36℃土1℃。
放大镜（放大5倍～10倍）或菌落计数器。接种环。
显微镜：10×~100×。
滤膜或一次性无菌滤膜：直径47mm，微孔径0.45μm。烧杯：500mL。
冰箱：2℃~8℃。
无菌滤器。
抽滤设备。
无菌三角瓶：300ml
5培养基、试剂
磷酸盐缓冲液：见A.2
无菌生理盐水：见A.3。
大肠埃希氏菌显色培养基：见A.4。营养琼脂：见A.5。
色氨酸肉汤：见A.6。
Kovacs靛基质试剂：见A.7。
MR-VP培养基：见A.8。
V-P甲、乙液：见A.9。
甲基红指示剂：见A.10。
Korser柠檬酸盐肉汤：见A.11。月桂基磺酸盐胰蛋白陈肉汤（LST肉汤）：见A.12。革兰氏染色液：见A.13。
IMViC生化鉴定试剂盒。
大肠埃希氏菌测试片。
注：本部分中稀释液均为磷酸盐缓冲液（5.1)或无菌生理盐水（5.2）。6
样品制备
6.1称量法
无菌方法打开送检的样品，用无菌剪刀（4.2）均匀剪样，在电子天平（4.3）上准确称取剪下的样品25g样品，剪碎后加人到盛有225mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个1：10的样品匀液。6.2多点采样洗脱法
无菌方法打开送检的样品，在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）按每个采样点20cm面积范围剪裁，每20平方厘米采样面积为1份检样，每个样品共采集5份检样，采样面积为100cm2。将上述采集好的5份检样放人盛有200mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混勾，得到一个洗脱液，制成样品匀液作为原液。2
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6.3棉拭子涂抹法
SN/T4656.2—2016
无菌操作方法打开送检的样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（4.7），在样品四周和中间均匀布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）比照按每个采样点20cm面积范围均勾涂抹，每个采样点用1个无菌干燥棉子（4.7），立即用无菌剪刀（4.2）剪去棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放人盛有50ml无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，制成1：10的样品勾液。6.4样品制备方法的选择
样品制备一般依6.1方法25g样品十225mL稀释液为基准方法，但当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用6.2方法。当出现以下情况时：a）样品质地致密不容易剪碎制备：b）样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用6.3方法。采用6.1，6.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液时，稀释液量可按整数倍递增，直至能有足够的测试样品匀液。采用6.2方法时如果被检样品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。7大肠埃希氏菌定量检验方法
：平板计数法
7.1原理
根据大肠埃希氏菌的形态特征和生理生化特性，大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶与大肠杆菌显色培养基内含有显色底物发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，能在显色平板上产生特定颜色的菌落。分纯后进行生化试验，确证后根据公式计算大肠埃希氏菌定量结果。7.2检验程序
检验程序见图1。
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液选取2个～3个合适的稀释度接种大肠埃希氏菌显色培养基
36℃±1℃
24h±2h
典型或可疑菌落接种营养琼脂平板36℃±1℃
色氨酸肉汤
MR-VP试验下载标准就来标准下载网
24h±2h
柠檬酸盐试验
乳糖发酵试验
计数证实为大肠埃希氏菌的菌落报告结果
图1大肠埃希氏菌平板计数法检验程序革兰氏染色
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7.3操作步骤
7.3.1样品均液稀释
用微量移液器（4.8）移取样品勾液1mL，缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌小三角瓶（4.9）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇小三角瓶（4.9）或换用1支无菌吸头（4.10）反复吹打使其混合均匀.制成下一稀释度的样品勾液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，更换1次无菌吸头（4.10）。
7.3.2样品接种
7.3.2.1检测时根据样品污染情况，选择2个～3个合适稀释度的样品匀液（包括原液）接种，在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别取2mL加人两个无菌平皿（4.11)中心，每个平皿1mL，另取1mL稀释液注人一个无菌平血（4.11)中心.作空白对照。7.3.2.2及时将冷却至45℃的大肠埃希氏菌显色培养基（5.3）[可放置45℃士1℃水浴箱（4.12)中保温10mL～15mL倾注于每个平血中：小心旋转平血，将培养基与样品匀液充分混匀。待凝固后翻转平板.倒置放人培养箱（4.13），36C土1℃C培养24h士2h，7.3.3典型菌落计数
7.3.3.1培养结束后应及时计数。可用肉眼观察；必要时用放大镜或菌落计数器（4.14）。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits.CFU）表示。7.3.3.2大肠埃希氏菌在显色培养基平板上菌落形态参照其显色培养基说明书观察判定。7.3.3.3选择有典型或可疑大肠埃希氏平板计数.计数合适范围为15CFU～150CFU，原则上尽可能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板，计数典型或可疑菌落数。如果：
只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在15CFU～150CFU之间，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数均小于15CFU，计数该稀释度两个平板上的典型或b)1
可疑菌落。
所有稀释度平板上的菌落数均大于150CFU且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
以上典型或可疑菌落确证后按式（1)计算。T=k ca
式中：
T—样品中大肠埃希氏菌菌落数；（1）
k一一根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1.6.3制备样品，k=1A一一某一稀释度两个平板典型或可疑菌落平均数：B——某一稀释度确证试验阳性的菌落数；C—某一试验中用于确证试验的菌落数：d稀释因子。
d）两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在15CFU～150CFU之间，则这两个连续稀释HiiKAoNiKAca
度平板上的典型或可疑菌落都应计数；菌落确证后按式（2)计算。T=kA,B/CI+A,B:×10/C
式中：
T样品中大肠埃希氏菌菌落数；
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.··（2)
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1、6.3制备样品，k=1；A，一一第一稀释度（低倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；B，一一第一稀释度（低倍稀释度）确证试验阳性的菌落数；C,一一某一试验中第一稀释度（低倍稀释度）用于确证试验的菌落数；A2一第二稀释度（高倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；B一一第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数：C一一某一试验中第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数；d一稀释因子（第一稀释度）。
e）所有稀释度的平板上都没有典型或可疑菌落.则直接以小于1乘以最低稀释倍数报告结果。f）如典型或可疑菌落计数出现其他情况，可先计算同一稀释度的两个平板平均数，选择典型或可疑菌落平均数在合适计数范围或接近合适计数范围的结果计数，如只有一个平均结果在计数范围内，确证后按式（1）计算结果，如两个平均结果都在计数范围内，确证后按式（2）计算。7.3.3.4一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见B.1.两个稀释度计数结果都在合适范围内情况参见B.2。
7.3.4确证试验
7.3.4.1从可计数的平板上任意排取典型或可疑菌落5个（小于5个全部挑取），分别接种营养琼脂（5.4）平板，36℃土1C培养24h二2h7.3.4.2用接种环（4.15)挑取营养琼脂（5.4)平板上已分离的单个菌落分别接种于生化培养基中观察菌落生化现象：
a）色氨酸肉汤（靛基质试验）
挑取单个菌落接种色氨酸肉汤（5.5）36C土1C培养21h士2h后.加Kovacs靛基质试剂(5.6)0.2mL～0.3mL，立即观察结果.上层出现红色者为靛基质试验阳性。b）MR-VP试验
VP试验：挑取单个菌落接种MR-VP培养基（5.7)）中，36℃士1℃C培养24h士2h后，按6：2的比例依次滴加V-P甲、乙液（5.8）后30min内观察结果，变红色为阳性，不变色为阴性。MR试验：挑取单个菌落MR-VP培养基（5.7)中，36℃士1℃培养48h士2h后.滴加甲基红试剂（5.9)2滴～3滴，立即观察结果，变红色为阳性，不变色为阴性。c）柠檬酸盐试验
挑取单个菌落接种Korser柠檬酸盐肉汤（5.10)后36℃土1℃培养96h土2h，观察其生长情况，有生长即为阳性。
d）乳糖发酵试验
挑取单个菌落接种LST肉汤（5.11)36℃土1℃培养24h士2h后，观察其产气情况，产气则能发酵乳糖。
e）革兰氏染色
取营养琼脂平板表面分纯菌落革兰氏染色液（5.12）染色，显微镜（4.16）下观察菌落形态，大肠5
HiiKAoNi KAca
SN/T4656.2-2016
埃希氏菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。以上生化试验同时进行可节约时间，也可以选用商用IMViC生化鉴定试剂盒（5.13)代替以上生化试剂，按产品说明书进行操作。7.3.4.3大肠埃希氏菌和非大肠埃希氏菌鉴别见表1，如出现表中以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时可做重复试验。表1大肠埃希氏菌和非大肠埃希氏菌生化鉴别靛基质(I)
甲基红（MR）
VP试验(VP)
柠檬酸盐(C)
鉴定结果
典型大肠埃希氏菌
非典型大肠埃希氏菌
典型中间型
非典型中间型
典型产气肠杆菌
非典型产气肠杆菌
7.3.4.4大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，靛基质试验、MR试验阳性，VP试验、柠檬酸盐试验阴性；或靛基质试验、VP试验、柠檬酸盐试验阴性，MR试验阳性。7.4结果报告
根据大肠埃希氏菌在显色培养基平板上典型或可疑菌落数，按照7.3.3中公式计算，报告每平方厘米、每克或每100平方厘米样品大肠埃希氏菌数，以CFU/cm、CFU/g或CFU/100cm表示。如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告：如T值小于100CFU，以实际数值报告；如T值大于或等于100CFU时，报告时数值按GB/T8170规则进行修约，用10的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。
8大肠埃希氏定量检验方法一
8.1原理
一微孔滤膜法
用生理盐水洗脱纺织品中的微生物，采用孔径为0.45um微孔薄膜快速抽提，此种滤膜能滤过大量液体，并将样品勾液中所含的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在大肠埃希氏菌测试片上，经过培养后，大肠埃希氏菌在其测试片上长出具有相应特征性的菌落，直接计数菌落数，根据样品制备方法对大肠埃希氏菌进行定量计算。
8.2检验程序
检验程序见图2。
8.3操作步骤
8.3.1样品均液稀释
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液10倍系列稀释
选择2个～3个连续的合适稀释度的样品匀液，抽滤，滤膜放置测试片上
36℃±℃
24h±2h
计数典型可疑菌落
计算结果
报告结果
图2大肠埃希氏微孔滤膜法检验程序SN/T4656.2—2016
用微量移液器（4.8）移取制备好的样品勾液20mL，缓慢注于盛有180mL稀释液的无菌三角瓶（4.22）中，振摇三角瓶使其混合均匀，制成下一稀释度的样品匀液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品勾液。每递增稀释1次，换用1次无菌吸头（4.10）。8.3.2样品接种
8.3.2.1如滤膜（4.17)未经灭菌，则使用前需将滤膜放入烧杯（4.18）中，加人蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min，前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜。
8.3.2.2从冰箱（4.19）中取出大肠埃希氏菌测试片（5.14），在室温下放置10min。揭开覆盖薄膜，吸取1000μL生理盐水（5.2)于测试片培养基上，盖上覆盖薄膜，常温放置1h，使测试片培养基完全水化（也可根据测试片说明书进行操作）8.3.2.3取出无菌滤器（4.20），用无菌镊子（4.2）夹取无菌滤膜（4.17）边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器（4.20），根据样品污染情况确定样品的稀释度，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜。取2个～3个合适稀释度样品匀液各50mL～100mL注人滤器中，打开抽滤设备（4.21）阀门，在一0.5大气压下抽滤。8.3.2.4样品匀液滤完后，再抽气约5S，关上阀门，取下滤器，用无菌镊子（4.2）夹取滤膜边缘部分，滤膜截留细菌面向上，移放在大肠埃希氏菌测试片（5.14）上，滤膜应与测试片完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将测试片放入36℃士1℃培养箱（4.13)内培养24h土2h。8.3.2.5大肠埃希氏菌在测试片上培养出的菌落特征按其说明书判定。SN/T4656.2—2016
3结果计算
直接计数微生物测试片上特征菌落，按式（3)计算。式中：
样品中大肠埃希氏菌菌落数；
T=k vd
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1.6.3制备样品，k=1A
-计数测试片上数出的大肠埃希氏菌落数；V
过滤的样液量；
稀释因子。
结果报告
如果样品原液培养基上无菌落长出，结果报告为0CFU/cm；如果10倍样品稀释液培养基上无菌落长出，结果报告为<10CFU/cm（CFU/g）或<10CFU/100cm，其他选择培养基上菌落数小于100CFU的平板计数，按式(3)计算报告。8
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进出口纺织品生物安全检验方法第2部分：大肠埃希氏菌
Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part2Escherichiacoli
2016-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T4656《进出口纺织品生物安全检验方法》共分为5部分：第1部分：白假丝酵母菌；
一第2部分：大肠埃希氏菌；
-第3部分：大肠菌群；
第4部分：金黄色葡萄球菌；
第5部分：菌落总数。
本部分为SN/T4656的第2部分。
本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4656.2—2016
本部分起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、江西省人民医院、四川农业大学。本部分主要起草人：郭会清、李、曹乾、郭华麟、禹建鹰、苗丽、杨娜、徐超、乔晴、王永杰。1
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1范围
进出口纺织品生物安全检验方法第2部分：大肠埃希氏菌
SN/T4656的本部分规定了进出口纺织品中大肠埃希氏菌的定量检验方法。SN/T4656.2—2016
本部分适用于进出口纺织品大肠埃希氏菌定量检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
纺织品生物安全biosafetyof textiles纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.2
大肠埃希氏菌Escherichiacoli
通称大肠杆菌，是埃希氏菌属的代表菌，广泛存在于人和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中的正常菌群，在一定条件下可引起肠道外感染，某些血清型菌株的致病性强，引起腹泻，能够在44.5℃发酵乳糖产酸产气，IMViC(靛基质、甲基红、VP试验、柠檬酸盐）生化试验为十十一一或一十一一的革兰氏阴性杆菌。
4设备与材料
常规微生物检测用的基本设备与材料。4.2
无菌剪刀、镊子。
4.3电子天平：0.01g。
4.4全滤网无菌均质袋
拍击式均质器：400mLc
4.6无菌规格板：20cm2。
无菌干燥棉拭子。
微量移液器：200μL~1000μL1mL10mL。4.9无菌小三角瓶：25mL。
HiiKAoNiKAca
SN/T4656.2—2016
无菌吸头：1000吨L，10mL。
无菌玻璃平皿或塑料平Ⅲ：15mm×90mm。恒温水浴箱：45℃土1℃。
恒温培养箱：36℃土1℃。
放大镜（放大5倍～10倍）或菌落计数器。接种环。
显微镜：10×~100×。
滤膜或一次性无菌滤膜：直径47mm，微孔径0.45μm。烧杯：500mL。
冰箱：2℃~8℃。
无菌滤器。
抽滤设备。
无菌三角瓶：300ml
5培养基、试剂
磷酸盐缓冲液：见A.2
无菌生理盐水：见A.3。
大肠埃希氏菌显色培养基：见A.4。营养琼脂：见A.5。
色氨酸肉汤：见A.6。
Kovacs靛基质试剂：见A.7。
MR-VP培养基：见A.8。
V-P甲、乙液：见A.9。
甲基红指示剂：见A.10。
Korser柠檬酸盐肉汤：见A.11。月桂基磺酸盐胰蛋白陈肉汤（LST肉汤）：见A.12。革兰氏染色液：见A.13。
IMViC生化鉴定试剂盒。
大肠埃希氏菌测试片。
注：本部分中稀释液均为磷酸盐缓冲液（5.1)或无菌生理盐水（5.2）。6
样品制备
6.1称量法
无菌方法打开送检的样品，用无菌剪刀（4.2）均匀剪样，在电子天平（4.3）上准确称取剪下的样品25g样品，剪碎后加人到盛有225mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个1：10的样品匀液。6.2多点采样洗脱法
无菌方法打开送检的样品，在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）按每个采样点20cm面积范围剪裁，每20平方厘米采样面积为1份检样，每个样品共采集5份检样，采样面积为100cm2。将上述采集好的5份检样放人盛有200mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混勾，得到一个洗脱液，制成样品匀液作为原液。2
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6.3棉拭子涂抹法
SN/T4656.2—2016
无菌操作方法打开送检的样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥棉拭子（4.7），在样品四周和中间均匀布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）比照按每个采样点20cm面积范围均勾涂抹，每个采样点用1个无菌干燥棉子（4.7），立即用无菌剪刀（4.2）剪去棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放人盛有50ml无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，制成1：10的样品勾液。6.4样品制备方法的选择
样品制备一般依6.1方法25g样品十225mL稀释液为基准方法，但当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用6.2方法。当出现以下情况时：a）样品质地致密不容易剪碎制备：b）样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用6.3方法。采用6.1，6.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品匀液时，稀释液量可按整数倍递增，直至能有足够的测试样品匀液。采用6.2方法时如果被检样品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。7大肠埃希氏菌定量检验方法
：平板计数法
7.1原理
根据大肠埃希氏菌的形态特征和生理生化特性，大肠杆菌β-葡萄糖醛酸苷酶与大肠杆菌显色培养基内含有显色底物发生特异性反应，水解底物，释放出显色基团，能在显色平板上产生特定颜色的菌落。分纯后进行生化试验，确证后根据公式计算大肠埃希氏菌定量结果。7.2检验程序
检验程序见图1。
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液选取2个～3个合适的稀释度接种大肠埃希氏菌显色培养基
36℃±1℃
24h±2h
典型或可疑菌落接种营养琼脂平板36℃±1℃
色氨酸肉汤
MR-VP试验下载标准就来标准下载网
24h±2h
柠檬酸盐试验
乳糖发酵试验
计数证实为大肠埃希氏菌的菌落报告结果
图1大肠埃希氏菌平板计数法检验程序革兰氏染色
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7.3操作步骤
7.3.1样品均液稀释
用微量移液器（4.8）移取样品勾液1mL，缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌小三角瓶（4.9）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇小三角瓶（4.9）或换用1支无菌吸头（4.10）反复吹打使其混合均匀.制成下一稀释度的样品勾液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，更换1次无菌吸头（4.10）。
7.3.2样品接种
7.3.2.1检测时根据样品污染情况，选择2个～3个合适稀释度的样品匀液（包括原液）接种，在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别取2mL加人两个无菌平皿（4.11)中心，每个平皿1mL，另取1mL稀释液注人一个无菌平血（4.11)中心.作空白对照。7.3.2.2及时将冷却至45℃的大肠埃希氏菌显色培养基（5.3）[可放置45℃士1℃水浴箱（4.12)中保温10mL～15mL倾注于每个平血中：小心旋转平血，将培养基与样品匀液充分混匀。待凝固后翻转平板.倒置放人培养箱（4.13），36C土1℃C培养24h士2h，7.3.3典型菌落计数
7.3.3.1培养结束后应及时计数。可用肉眼观察；必要时用放大镜或菌落计数器（4.14）。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits.CFU）表示。7.3.3.2大肠埃希氏菌在显色培养基平板上菌落形态参照其显色培养基说明书观察判定。7.3.3.3选择有典型或可疑大肠埃希氏平板计数.计数合适范围为15CFU～150CFU，原则上尽可能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板，计数典型或可疑菌落数。如果：
只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在15CFU～150CFU之间，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数均小于15CFU，计数该稀释度两个平板上的典型或b)1
可疑菌落。
所有稀释度平板上的菌落数均大于150CFU且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
以上典型或可疑菌落确证后按式（1)计算。T=k ca
式中：
T—样品中大肠埃希氏菌菌落数；（1）
k一一根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1.6.3制备样品，k=1A一一某一稀释度两个平板典型或可疑菌落平均数：B——某一稀释度确证试验阳性的菌落数；C—某一试验中用于确证试验的菌落数：d稀释因子。
d）两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在15CFU～150CFU之间，则这两个连续稀释HiiKAoNiKAca
度平板上的典型或可疑菌落都应计数；菌落确证后按式（2)计算。T=kA,B/CI+A,B:×10/C
式中：
T样品中大肠埃希氏菌菌落数；
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.··（2)
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1、6.3制备样品，k=1；A，一一第一稀释度（低倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；B，一一第一稀释度（低倍稀释度）确证试验阳性的菌落数；C,一一某一试验中第一稀释度（低倍稀释度）用于确证试验的菌落数；A2一第二稀释度（高倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；B一一第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数：C一一某一试验中第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数；d一稀释因子（第一稀释度）。
e）所有稀释度的平板上都没有典型或可疑菌落.则直接以小于1乘以最低稀释倍数报告结果。f）如典型或可疑菌落计数出现其他情况，可先计算同一稀释度的两个平板平均数，选择典型或可疑菌落平均数在合适计数范围或接近合适计数范围的结果计数，如只有一个平均结果在计数范围内，确证后按式（1）计算结果，如两个平均结果都在计数范围内，确证后按式（2）计算。7.3.3.4一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见B.1.两个稀释度计数结果都在合适范围内情况参见B.2。
7.3.4确证试验
7.3.4.1从可计数的平板上任意排取典型或可疑菌落5个（小于5个全部挑取），分别接种营养琼脂（5.4）平板，36℃土1C培养24h二2h7.3.4.2用接种环（4.15)挑取营养琼脂（5.4)平板上已分离的单个菌落分别接种于生化培养基中观察菌落生化现象：
a）色氨酸肉汤（靛基质试验）
挑取单个菌落接种色氨酸肉汤（5.5）36C土1C培养21h士2h后.加Kovacs靛基质试剂(5.6)0.2mL～0.3mL，立即观察结果.上层出现红色者为靛基质试验阳性。b）MR-VP试验
VP试验：挑取单个菌落接种MR-VP培养基（5.7)）中，36℃士1℃C培养24h士2h后，按6：2的比例依次滴加V-P甲、乙液（5.8）后30min内观察结果，变红色为阳性，不变色为阴性。MR试验：挑取单个菌落MR-VP培养基（5.7)中，36℃士1℃培养48h士2h后.滴加甲基红试剂（5.9)2滴～3滴，立即观察结果，变红色为阳性，不变色为阴性。c）柠檬酸盐试验
挑取单个菌落接种Korser柠檬酸盐肉汤（5.10)后36℃土1℃培养96h土2h，观察其生长情况，有生长即为阳性。
d）乳糖发酵试验
挑取单个菌落接种LST肉汤（5.11)36℃土1℃培养24h士2h后，观察其产气情况，产气则能发酵乳糖。
e）革兰氏染色
取营养琼脂平板表面分纯菌落革兰氏染色液（5.12）染色，显微镜（4.16）下观察菌落形态，大肠5
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埃希氏菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。以上生化试验同时进行可节约时间，也可以选用商用IMViC生化鉴定试剂盒（5.13)代替以上生化试剂，按产品说明书进行操作。7.3.4.3大肠埃希氏菌和非大肠埃希氏菌鉴别见表1，如出现表中以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时可做重复试验。表1大肠埃希氏菌和非大肠埃希氏菌生化鉴别靛基质(I)
甲基红（MR）
VP试验(VP)
柠檬酸盐(C)
鉴定结果
典型大肠埃希氏菌
非典型大肠埃希氏菌
典型中间型
非典型中间型
典型产气肠杆菌
非典型产气肠杆菌
7.3.4.4大肠埃希氏菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，靛基质试验、MR试验阳性，VP试验、柠檬酸盐试验阴性；或靛基质试验、VP试验、柠檬酸盐试验阴性，MR试验阳性。7.4结果报告
根据大肠埃希氏菌在显色培养基平板上典型或可疑菌落数，按照7.3.3中公式计算，报告每平方厘米、每克或每100平方厘米样品大肠埃希氏菌数，以CFU/cm、CFU/g或CFU/100cm表示。如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告：如T值小于100CFU，以实际数值报告；如T值大于或等于100CFU时，报告时数值按GB/T8170规则进行修约，用10的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。
8大肠埃希氏定量检验方法一
8.1原理
一微孔滤膜法
用生理盐水洗脱纺织品中的微生物，采用孔径为0.45um微孔薄膜快速抽提，此种滤膜能滤过大量液体，并将样品勾液中所含的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在大肠埃希氏菌测试片上，经过培养后，大肠埃希氏菌在其测试片上长出具有相应特征性的菌落，直接计数菌落数，根据样品制备方法对大肠埃希氏菌进行定量计算。
8.2检验程序
检验程序见图2。
8.3操作步骤
8.3.1样品均液稀释
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液10倍系列稀释
选择2个～3个连续的合适稀释度的样品匀液，抽滤，滤膜放置测试片上
36℃±℃
24h±2h
计数典型可疑菌落
计算结果
报告结果
图2大肠埃希氏微孔滤膜法检验程序SN/T4656.2—2016
用微量移液器（4.8）移取制备好的样品勾液20mL，缓慢注于盛有180mL稀释液的无菌三角瓶（4.22）中，振摇三角瓶使其混合均匀，制成下一稀释度的样品匀液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品勾液。每递增稀释1次，换用1次无菌吸头（4.10）。8.3.2样品接种
8.3.2.1如滤膜（4.17)未经灭菌，则使用前需将滤膜放入烧杯（4.18）中，加人蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每次15min，前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次～3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无菌滤膜。
8.3.2.2从冰箱（4.19）中取出大肠埃希氏菌测试片（5.14），在室温下放置10min。揭开覆盖薄膜，吸取1000μL生理盐水（5.2)于测试片培养基上，盖上覆盖薄膜，常温放置1h，使测试片培养基完全水化（也可根据测试片说明书进行操作）8.3.2.3取出无菌滤器（4.20），用无菌镊子（4.2）夹取无菌滤膜（4.17）边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器（4.20），根据样品污染情况确定样品的稀释度，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜。取2个～3个合适稀释度样品匀液各50mL～100mL注人滤器中，打开抽滤设备（4.21）阀门，在一0.5大气压下抽滤。8.3.2.4样品匀液滤完后，再抽气约5S，关上阀门，取下滤器，用无菌镊子（4.2）夹取滤膜边缘部分，滤膜截留细菌面向上，移放在大肠埃希氏菌测试片（5.14）上，滤膜应与测试片完全贴紧，两者间不得留有气泡，然后将测试片放入36℃士1℃培养箱（4.13)内培养24h土2h。8.3.2.5大肠埃希氏菌在测试片上培养出的菌落特征按其说明书判定。SN/T4656.2—2016
3结果计算
直接计数微生物测试片上特征菌落，按式（3)计算。式中：
样品中大肠埃希氏菌菌落数；
T=k vd
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1.6.3制备样品，k=1A
-计数测试片上数出的大肠埃希氏菌落数；V
过滤的样液量；
稀释因子。
结果报告
如果样品原液培养基上无菌落长出，结果报告为0CFU/cm；如果10倍样品稀释液培养基上无菌落长出，结果报告为<10CFU/cm（CFU/g）或<10CFU/100cm，其他选择培养基上菌落数小于100CFU的平板计数，按式(3)计算报告。8
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