SN/T 4656.1-2016
基本信息
标准号： SN/T 4656.1-2016
中文名称：进出口纺织品生物安全检验方法第1部分:白假丝酵母菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4656.1-2016.Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part 1 :Candida albicans.
1范围
SN/T 4656.1规定了进出口纺织品中白假丝酵母菌的定性定量检验方法。
SN/T 4656.1适用于进出口纺织品白假丝酵母菌的检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
SN/T 1538.1培养基制备指南 第1 部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1538.2培养基制备指南第2部分:培养基性能测试实用指南
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1纺织品生物安全biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。
3.2白假丝酵母菌C.albicans
一种真菌，也叫白色念珠菌.细胞呈圆形或卵圆形.直径3 μm~6 μm.出芽繁殖.主要特征表现为可形成假菌丝、芽管和厚膜孢子,不产生囊孢子、掷孢子、关节孢子,不能利用肌醇做为碳源大多数菌种需氧,主要寄生在人体的体表及口腔咽喉、呼吸道、肠道、阴道黏膜上.当机体免疫力下降时.易引起局部甚至系统性感染。
4设备与材料
4.1常 规微生物检测用的基本设备与材料。
4.2无菌剪刀。
4.3电子天平:0.01 g。
4.4全滤网无菌均质袋。
4.5拍击式均质 器:400 mL。
1范围
SN/T 4656.1规定了进出口纺织品中白假丝酵母菌的定性定量检验方法。
SN/T 4656.1适用于进出口纺织品白假丝酵母菌的检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
SN/T 1538.1培养基制备指南 第1 部分:实验室培养基制备质量保证通则
SN/T1538.2培养基制备指南第2部分:培养基性能测试实用指南
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1纺织品生物安全biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。
3.2白假丝酵母菌C.albicans
一种真菌，也叫白色念珠菌.细胞呈圆形或卵圆形.直径3 μm~6 μm.出芽繁殖.主要特征表现为可形成假菌丝、芽管和厚膜孢子,不产生囊孢子、掷孢子、关节孢子,不能利用肌醇做为碳源大多数菌种需氧,主要寄生在人体的体表及口腔咽喉、呼吸道、肠道、阴道黏膜上.当机体免疫力下降时.易引起局部甚至系统性感染。
4设备与材料
4.1常 规微生物检测用的基本设备与材料。
4.2无菌剪刀。
4.3电子天平:0.01 g。
4.4全滤网无菌均质袋。
4.5拍击式均质 器:400 mL。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4656.1—2016
进出口纺织品生物安全检验方法第1部分：白假丝酵母菌
Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part 1:Candida albicans
2016-12-12发布bZxz.net
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T4656《进出口纺织品生物安全检验方法》共分为5部分：第1部分：白假丝酵母菌；
一第2部分：大肠埃希氏菌：
第3部分：大肠菌群；
第4部分：金黄色葡萄球菌：
第5部分：菌落总数。
本部分为SN/T4656的第1部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、四川农业大学。SN/T4656.1—2016
本部分主要起草人：李柯、郭会清、乔晴、禹建鹰、郭华麟、苗丽、徐超、杨娜、王永杰Hii KAoNi KAca
HiKAoNiKAca
1范围
进出口纺织品生物安全检验方法第1部分：自假丝酵母菌
SN/T4656.1—2016
SV/T4656的本部分规定了进出口纺织品中白假丝酵母菌的定性、定量检验方法。本部分适用于进出口纺织品白假丝酵母菌的检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则S.V/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
纺织品生物安全
biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.2
白假丝酵母菌C.albicans
一种真菌，也叫白色念珠菌.细胞呈圆形或卵圆形，直径3um一6um，出芽繁殖.主要特征表现为可形成假菌丝、芽管和厚膜孢子，不产生囊孢子、掷孢子、关节孢子，不能利用肌醇做为碳源.大多数菌种需氧，主要寄生在人体的体表及口腔咽喉、呼吸道、肠道、阴道黏膜上，当机体免疫力下降时·易引起局部甚至系统性感染。
4设备与材料
常规微生物检测用的基本设备与材料。4.2
无菌剪刀。
电子天平：0.01g。
全滤网无菌均质袋。
拍击式均质器：400mL。
无菌规格板：20cm2。
无菌干燥棉拭子。
恒温培养箱：28℃土1℃，45℃土1℃1
HiiKAoNiKAca
SN/T4656.1—2016
4.9接种环。
麦氏比浊管。
微量移液器：20μL200μL、200μL~1000μl、1mL~5mL。4.12
2无菌试管：10mm×100mm。
3恒温水浴箱：45℃土1℃、36℃土1℃。4.13
载玻片。
5盖玻片。
显微镜：10×～100×。
无菌小三角瓶：25mL
无菌吸头：200μL1000μL.5mL。无菌玻璃平血或一次性无菌塑料平皿：15mm×90mm。放大镜（放大5倍10倍）或菌落计数器。5培养基、试剂
5.1无菌生理盐水：见A.2。
5.2麦芽浸膏肉汤（MEB肉汤）：见A.3。5.3念珠菌显色培养基：见A.4。CandidaElective琼脂：见A.5。5.4
5.51%吐温80-玉米琼脂培养基：见A.6。5.6兔血清：见A.7。
5.7革兰氏染色液：见A.8。
注：本部分中无菌稀释液均为无菌生理盐水（5.1)或麦芽浸膏肉汤（5.2)。6样品制备
6.1称量法
无菌方法打开送检的样品，用无菌剪刀（4.2）均勾剪样，在电子天平（4.3）上准确称取剪下的样品25g样品。剪碎后加人到盛有225mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混勾，得到一个1：10的样品匀液。6.2多点采样洗脱法
无菌方法打开送检的样品，在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）按每个采样点20cm2面积范围剪裁，每20cm2采样面积为1份检样，每个样品共采集5份检样，采样面积为100cm。将上述采集好的5份检样放人盛有200mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个洗脱液，制成样品匀液作为原液。6.3棉拭子涂抹法
无菌操作方法打开送检的样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥的棉拭子（4.7），在样品四周和中间均匀布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）比照按每个采样点20cm面积范围均勾涂抹，每个采样点用1个无菌干燥棉拭子（4.7），立即用无菌剪刀（4.2）剪去棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放人盛有50mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，制成1：10的样品勾液。iiKAoNiKAca
6.4样品制备方法的选择
SN/T4656.1—2016
样品制备一般依6.1方法25g样品十225mL无菌稀释液为基准方法，但当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用6.2方法。当出现以下情况时：a)样品质地致密不容易剪碎制备：b)样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用6.3方法。采用6.1、6.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品勾液时，稀释液量可按整数倍递增，直至能有足够的测试样品匀液。采用6.2方法时如果被检样品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。7自假丝酵母菌定性检验方法
7.1原理
根据白假丝酵母菌致病株（菌丝相菌株才有致病能力）形态特征和生理生化特性，选用改良的选择性培养基，经过传统培养分纯菌株，观察芽管、菌丝、假菌丝、厚膜孢子形成，根据白假丝酵母菌45℃生长的特点，鉴定白假丝酵母菌。检验程序
检验程序见图1。
按6.1，6.2、6.3制备的样品匀液28±1℃
48h±2h
念珠菌显色培养基平板和CandidaElective琼脂平板28℃±1℃
48h±2h
可疑菌落接种1%吐温80-玉米琼脂培养基28℃±1℃
芽管试验
观察假菌丝和厚膜孢子
结果报告
48h±2h
45生长试验
自假丝酵母菌定性检验程序
7.3操作步骤
7.3.1增菌
如按6.1制备样品，则称取25g样品，剪碎后加人到盛有225mL麦芽浸膏肉汤（5.2）的全滤网无菌均质袋（4.4）内均质：如按6.2制备样品，将6.2采集好的5份检样放人盛有200mL麦芽浸膏肉汤（5.2）3
Hii KAoNi KAca
SN/T4656.1--2016
的全滤网无菌均质袋（4.4）内均质：如按6.3制备样品，则将棉拭子涂抹部分一块放人盛有50mL麦芽浸膏肉汤（5.2）的全滤网无菌均质袋（4.4）内混匀.样品制备好后均放人28C土1C恒温培养箱（4.8）增菌培养18h士2h。
7.3.2分离
将培养后的增菌液接种念珠菌显色培养基（5.3）平板和CandidaElective琼脂（5.4）平板.28℃士1℃培养48h土2h，观察菌落形态。白假丝酵母菌在念珠菌显色培养基（5.3）上菌落形态参照其说明书观察。白假丝酵母菌在CandidaElective琼脂（5.4）平板上呈深棕色小菌落，圆形凸起，边缘整齐，表面干燥成磨砂样.用无菌接种环（4.9）接触后有类似巧克力融化后的样子。如培养50h后两种平板上均无典型或可疑菌落生长.则可直接报告白假丝酵母菌未检出。从有典型或可疑菌落的各类平板上至少挑取5个（少于5个全部挑取）典型或可菌落进行如下确证试验。7.3.3确证试验
7.3.3.1菌落纯化
用无菌接种环（4.9）挑取上述平板上典型或可疑单个菌落分别接种到两个1%吐温80-玉米琼脂培养基（5.5）平板上，28℃土1℃培养48h土2h，分离纯化7.3.3.2芽管试验
取1%吐温80-玉米琼脂培养基（5.5）平板上单个菌落至无菌生理盐水（5.1）中，仔细研磨成乳状液，与麦氏比浊管（4.10）对比，制成含菌量约10°个/mL菌液，用微量移液器（4.11）吸取20μL接种于含0.5mL兔血清（5.6）的无菌试管（4.12）中，36℃土1水浴箱（4.13）中孵育2h3h，取出混勾.吸取20μL菌液置干净载玻片（4.14）上，盖上盖玻片（4.15），显微镜（4.16）下观察芽管。白假丝酵母菌产生的芽管和芽生孢子连接处，不出现收缩现象，称为箭状。用其他酵母菌、白假丝酵母菌做阴阳性对照，孵育时间不超过3h。
7.3.3.3镜检观察菌丝、假菌丝和厚膜孢子染色镜检观察假菌丝和厚膜孢子。挑取1%吐温80-玉米琼脂培养基（5.5）平板上28℃土1℃培养48h土2h纯化菌落，涂片，革兰氏染色液（5.7）染色，镜检。显微镜（4.16）下观察白假丝酵母菌为革兰氏阳性酵母菌，着色不均，有丰富的假菌丝，假菌丝中隔部伴有成族的圆形分生抱子，在假菌丝中间或顶端有较大圆形厚膜孢子。
7.3.3.445℃生长试验
挑取纯化单个菌落接种麦芽浸膏肉汤（MEB肉汤）（5.2）培养基中.45℃土1℃培养48h～72h。白假丝酵母菌在麦芽浸膏肉汤（MEB肉汤）（5.2）中45℃土1℃能生长。7.3.4结果判定
当分离出的可疑菌落有芽管形成，能观察到菌丝、假菌丝和厚膜孢子，同时能在45℃环境中生长，可判定为白假丝酵母菌。
7.4结果报告
结果报告为检出或未检出白假丝酵母菌。+
iiKAoNiKAca
8自假丝酵母菌定量检验方法一
一平板计数法
8.1原理
SN/T4656.1—2016
根据白假丝酵母菌致病株（菌丝相菌株才有致病能力）形态特征和生理生化特性，选用改良的选择性培养基培养计数，对可疑菌落分纯，观察芽管、菌丝、假菌丝、及厚膜孢子的形成，根据白假丝酵母菌45℃生长的特点，鉴定白假丝酵母菌。按相应公式计算出白假丝酵母菌定量结果。8.2检验程序
检验程序见图2。
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液10倍系列稀释
选择2个～3个连续的适宜稀释度的样品匀液，接种CandidaElective琼脂平板
28±1r
48h土2h
挑取可疑菌做确证试验
计数证实为白假丝醇母菌的酋
结果报告
图2白假丝酵母菌平板计数检验程序8.3操作步骤
8.3.1样品的稀释
用微量移液器（4.11)移取制备好的样品勾液1mL，缓慢注于盛有9mL无菌稀释液的无菌小三角瓶（4.17）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇小三角瓶或换用1支无菌吸头（4.18）反复吹打使其混合均勾，制成下一稀释度的样品勾液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品勾液。每递增稀释1次.换用1次无菌吸头（4.18）。8.3.2样品接种
8.3.2.1接种时根据样品的实际污染情况，选择2个3个合适的稀释度的样品匀液（包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平血（4.19)内.每个稀释度接种两个平血。同时分别吸取1mL空白稀释液加人两个无菌平皿（4.19）内做空白对照。8.3.2.2及时将15mL～20mL冷却至45℃±0.5℃［可放置45℃±1℃水浴箱（4.13）中保温］的CandidaElective琼脂（5.4)倾注平血，边倾注边转动平血使其混合均勾。5
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8.3.3培养
待琼脂凝固后，将平血翻转.倒置28C士1℃C培养48h土2h。8.3.4典型菌落计数和确认
8.3.4.1培养结束后应及时计数，可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器（4.20）。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。8.3.4.2白假丝酵母菌在CandidaElective琼脂（5.4）平板上典型菌落呈深棕色小菌落，圆形凸起，边缘整齐，表面干燥成磨砂样，用无菌接种环（4.9）接触后有类似巧克力融化后的样子。8.3.4.3选择有典型或可疑白假丝酵母菌菌落的平板计数。合适的计数范围为15CFU～150CFU，原则上尽可能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板，计数典型或可疑菌落数。如果：
a）只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在15CFU～150CFU之间，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
b）最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数均小于15CFU，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
所有稀释度平板上的菌落数均大于150CFU且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度两个平c）
板上的典型或可疑菌落。
以上典型或可疑菌落确证后按式（1）计算。AB
式中：
样品中白假丝酵母菌菌落数：
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1、6.3制备样品，k=1；某一稀释度两个平板典型或可疑菌落平均数；某一稀释度确证试验阳性的菌落数：某一试验中用于确证试验的菌落数；稀释因子。
两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在15CFU～150CFU之间.则这两个连续稀释d
度平板上的典型或可疑菌落都应计数。菌落确证后按式(2)计算。A,B/C/+A2B2X10/C2
式中：
样品中白假丝酵母菌菌落数：
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2：按6.1、6.3制备样品，k=1；第一稀释度（低倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；第一稀释度(低倍稀释度)确证试验阳性的菌落数；第一稀释度（低倍稀释度）用于确证试验的菌落数：第二稀释度(高倍稀释度)两个平板典型或可疑菌落平均数；第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数：第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数：稀释因子（第一稀释度）。
e）月
所有稀释度的平板上都没有典型或可菌落，则直接以小于1乘以最低稀释倍数报告结果。6
SN/T4656.1—2016
如典型或可疑菌落计数出现其他情况，可先计算同一稀释度的两个平板平均数，选择典型或可f)
疑菌落平均数在合适计数范围或接近合适计数范围的结果计数，如只有一个平均结果在计数范围内，确证后按式（1)计算结果，如两个平均结果都在计数范围内，确证后按式(2)计算。8.3.4.4一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见B.1，两个稀释度计数结果都在合适范围内情况参见B.2。
8.3.4.5从可计数的平板上任意挑取典型或可疑菌落5个（小于5个全部挑取），分别按7.3.3做确证试验。
8.4结果报告
根据CandidaElective琼脂平板上典型或可疑菌落总数，按照8.3.4中公式计算，报告每平方厘米、每克或每100平方厘米样品白假丝酵母菌数，以CFU/cm2CFU/g或CFU/100cm2表示。如T值为O，则以小于1乘以最低稀释倍数报告：如T值小于100CFU，以实际数值报告：如T值大于或等于100CFU时，报告时数值按GB/T8170规则进行修约，用10的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。
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A.1培养基制备及质量保证
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
按SN/T1538.1和SN/T1538.2.并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效商品化脱水合成培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。A.2无菌生理盐水
A.2.1成分
氯化钠
蒸馏水
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。3麦芽浸膏肉汤（MEB）
A.3.1成分
麦芽浸膏
蒸馏水
1000mL
将麦芽浸膏在蒸馏水中充分溶解，滤纸过滤，调至pH4.7士0.2.分装，121℃灭菌15min。如无麦芽浸膏，可按下法制备：用饱满健壮大麦粒在温水中浸透，置温暖处发芽，幼芽长达到2mm时，沥干余水，干透，磨细使成麦芽粉。制备培养基时，取麦芽粉30g加水300mL，混勾，在60℃～70℃浸渍1h，吸出上层水。再同样加水浸渍一次，取上层水，合并两次上层水，并补加水至1000mL，滤纸过滤。调至pH4.7土0.2，分装，121℃灭菌15min。A.4念珠菌显色培养基
A.4.1成分
营养物质（蛋白陈等）
氯霉素
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进出口纺织品生物安全检验方法第1部分：白假丝酵母菌
Biosafety testing methods of the textiles for import and export-Part 1:Candida albicans
2016-12-12发布bZxz.net
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T4656《进出口纺织品生物安全检验方法》共分为5部分：第1部分：白假丝酵母菌；
一第2部分：大肠埃希氏菌：
第3部分：大肠菌群；
第4部分：金黄色葡萄球菌：
第5部分：菌落总数。
本部分为SN/T4656的第1部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国河南出人境检验检疫局、四川农业大学。SN/T4656.1—2016
本部分主要起草人：李柯、郭会清、乔晴、禹建鹰、郭华麟、苗丽、徐超、杨娜、王永杰Hii KAoNi KAca
HiKAoNiKAca
1范围
进出口纺织品生物安全检验方法第1部分：自假丝酵母菌
SN/T4656.1—2016
SV/T4656的本部分规定了进出口纺织品中白假丝酵母菌的定性、定量检验方法。本部分适用于进出口纺织品白假丝酵母菌的检验。其他纺织类产品可参考使用本部分。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件.仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则S.V/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
纺织品生物安全
biosafety of textiles
纺织品中携带的有害生物本身或其代谢产物对生态环境和人体健康产生的潜在威胁，及对其所采取的一系列有效预防和控制措施。3.2
白假丝酵母菌C.albicans
一种真菌，也叫白色念珠菌.细胞呈圆形或卵圆形，直径3um一6um，出芽繁殖.主要特征表现为可形成假菌丝、芽管和厚膜孢子，不产生囊孢子、掷孢子、关节孢子，不能利用肌醇做为碳源.大多数菌种需氧，主要寄生在人体的体表及口腔咽喉、呼吸道、肠道、阴道黏膜上，当机体免疫力下降时·易引起局部甚至系统性感染。
4设备与材料
常规微生物检测用的基本设备与材料。4.2
无菌剪刀。
电子天平：0.01g。
全滤网无菌均质袋。
拍击式均质器：400mL。
无菌规格板：20cm2。
无菌干燥棉拭子。
恒温培养箱：28℃土1℃，45℃土1℃1
HiiKAoNiKAca
SN/T4656.1—2016
4.9接种环。
麦氏比浊管。
微量移液器：20μL200μL、200μL~1000μl、1mL~5mL。4.12
2无菌试管：10mm×100mm。
3恒温水浴箱：45℃土1℃、36℃土1℃。4.13
载玻片。
5盖玻片。
显微镜：10×～100×。
无菌小三角瓶：25mL
无菌吸头：200μL1000μL.5mL。无菌玻璃平血或一次性无菌塑料平皿：15mm×90mm。放大镜（放大5倍10倍）或菌落计数器。5培养基、试剂
5.1无菌生理盐水：见A.2。
5.2麦芽浸膏肉汤（MEB肉汤）：见A.3。5.3念珠菌显色培养基：见A.4。CandidaElective琼脂：见A.5。5.4
5.51%吐温80-玉米琼脂培养基：见A.6。5.6兔血清：见A.7。
5.7革兰氏染色液：见A.8。
注：本部分中无菌稀释液均为无菌生理盐水（5.1)或麦芽浸膏肉汤（5.2)。6样品制备
6.1称量法
无菌方法打开送检的样品，用无菌剪刀（4.2）均勾剪样，在电子天平（4.3）上准确称取剪下的样品25g样品。剪碎后加人到盛有225mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混勾，得到一个1：10的样品匀液。6.2多点采样洗脱法
无菌方法打开送检的样品，在样品四周和中间均勾布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）按每个采样点20cm2面积范围剪裁，每20cm2采样面积为1份检样，每个样品共采集5份检样，采样面积为100cm。将上述采集好的5份检样放人盛有200mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4）中，用拍击式均质器（4.5）拍打1min～2min，充分混匀，得到一个洗脱液，制成样品匀液作为原液。6.3棉拭子涂抹法
无菌操作方法打开送检的样品，用无菌稀释液湿润无菌干燥的棉拭子（4.7），在样品四周和中间均匀布控5个采样点，用无菌规格板（4.6）比照按每个采样点20cm面积范围均勾涂抹，每个采样点用1个无菌干燥棉拭子（4.7），立即用无菌剪刀（4.2）剪去棉拭子手接触部分，将涂抹部分一块放人盛有50mL无菌稀释液的全滤网无菌均质袋（4.4)中，制成1：10的样品勾液。iiKAoNiKAca
6.4样品制备方法的选择
SN/T4656.1—2016
样品制备一般依6.1方法25g样品十225mL无菌稀释液为基准方法，但当样品为面积较大或较厚实或多孔时，样品制备应采用6.2方法。当出现以下情况时：a)样品质地致密不容易剪碎制备：b)样品较贵重，客户要求无损检测的，样品制备应采用6.3方法。采用6.1、6.2方法时如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样品勾液时，稀释液量可按整数倍递增，直至能有足够的测试样品匀液。采用6.2方法时如果被检样品面积过大或过小，采样点可按比例增加或减少。7自假丝酵母菌定性检验方法
7.1原理
根据白假丝酵母菌致病株（菌丝相菌株才有致病能力）形态特征和生理生化特性，选用改良的选择性培养基，经过传统培养分纯菌株，观察芽管、菌丝、假菌丝、厚膜孢子形成，根据白假丝酵母菌45℃生长的特点，鉴定白假丝酵母菌。检验程序
检验程序见图1。
按6.1，6.2、6.3制备的样品匀液28±1℃
48h±2h
念珠菌显色培养基平板和CandidaElective琼脂平板28℃±1℃
48h±2h
可疑菌落接种1%吐温80-玉米琼脂培养基28℃±1℃
芽管试验
观察假菌丝和厚膜孢子
结果报告
48h±2h
45生长试验
自假丝酵母菌定性检验程序
7.3操作步骤
7.3.1增菌
如按6.1制备样品，则称取25g样品，剪碎后加人到盛有225mL麦芽浸膏肉汤（5.2）的全滤网无菌均质袋（4.4）内均质：如按6.2制备样品，将6.2采集好的5份检样放人盛有200mL麦芽浸膏肉汤（5.2）3
Hii KAoNi KAca
SN/T4656.1--2016
的全滤网无菌均质袋（4.4）内均质：如按6.3制备样品，则将棉拭子涂抹部分一块放人盛有50mL麦芽浸膏肉汤（5.2）的全滤网无菌均质袋（4.4）内混匀.样品制备好后均放人28C土1C恒温培养箱（4.8）增菌培养18h士2h。
7.3.2分离
将培养后的增菌液接种念珠菌显色培养基（5.3）平板和CandidaElective琼脂（5.4）平板.28℃士1℃培养48h土2h，观察菌落形态。白假丝酵母菌在念珠菌显色培养基（5.3）上菌落形态参照其说明书观察。白假丝酵母菌在CandidaElective琼脂（5.4）平板上呈深棕色小菌落，圆形凸起，边缘整齐，表面干燥成磨砂样.用无菌接种环（4.9）接触后有类似巧克力融化后的样子。如培养50h后两种平板上均无典型或可疑菌落生长.则可直接报告白假丝酵母菌未检出。从有典型或可疑菌落的各类平板上至少挑取5个（少于5个全部挑取）典型或可菌落进行如下确证试验。7.3.3确证试验
7.3.3.1菌落纯化
用无菌接种环（4.9）挑取上述平板上典型或可疑单个菌落分别接种到两个1%吐温80-玉米琼脂培养基（5.5）平板上，28℃土1℃培养48h土2h，分离纯化7.3.3.2芽管试验
取1%吐温80-玉米琼脂培养基（5.5）平板上单个菌落至无菌生理盐水（5.1）中，仔细研磨成乳状液，与麦氏比浊管（4.10）对比，制成含菌量约10°个/mL菌液，用微量移液器（4.11）吸取20μL接种于含0.5mL兔血清（5.6）的无菌试管（4.12）中，36℃土1水浴箱（4.13）中孵育2h3h，取出混勾.吸取20μL菌液置干净载玻片（4.14）上，盖上盖玻片（4.15），显微镜（4.16）下观察芽管。白假丝酵母菌产生的芽管和芽生孢子连接处，不出现收缩现象，称为箭状。用其他酵母菌、白假丝酵母菌做阴阳性对照，孵育时间不超过3h。
7.3.3.3镜检观察菌丝、假菌丝和厚膜孢子染色镜检观察假菌丝和厚膜孢子。挑取1%吐温80-玉米琼脂培养基（5.5）平板上28℃土1℃培养48h土2h纯化菌落，涂片，革兰氏染色液（5.7）染色，镜检。显微镜（4.16）下观察白假丝酵母菌为革兰氏阳性酵母菌，着色不均，有丰富的假菌丝，假菌丝中隔部伴有成族的圆形分生抱子，在假菌丝中间或顶端有较大圆形厚膜孢子。
7.3.3.445℃生长试验
挑取纯化单个菌落接种麦芽浸膏肉汤（MEB肉汤）（5.2）培养基中.45℃土1℃培养48h～72h。白假丝酵母菌在麦芽浸膏肉汤（MEB肉汤）（5.2）中45℃土1℃能生长。7.3.4结果判定
当分离出的可疑菌落有芽管形成，能观察到菌丝、假菌丝和厚膜孢子，同时能在45℃环境中生长，可判定为白假丝酵母菌。
7.4结果报告
结果报告为检出或未检出白假丝酵母菌。+
iiKAoNiKAca
8自假丝酵母菌定量检验方法一
一平板计数法
8.1原理
SN/T4656.1—2016
根据白假丝酵母菌致病株（菌丝相菌株才有致病能力）形态特征和生理生化特性，选用改良的选择性培养基培养计数，对可疑菌落分纯，观察芽管、菌丝、假菌丝、及厚膜孢子的形成，根据白假丝酵母菌45℃生长的特点，鉴定白假丝酵母菌。按相应公式计算出白假丝酵母菌定量结果。8.2检验程序
检验程序见图2。
按6.1、6.2、6.3制备的样品匀液10倍系列稀释
选择2个～3个连续的适宜稀释度的样品匀液，接种CandidaElective琼脂平板
28±1r
48h土2h
挑取可疑菌做确证试验
计数证实为白假丝醇母菌的酋
结果报告
图2白假丝酵母菌平板计数检验程序8.3操作步骤
8.3.1样品的稀释
用微量移液器（4.11)移取制备好的样品勾液1mL，缓慢注于盛有9mL无菌稀释液的无菌小三角瓶（4.17）中（注意吸头尖端不要触及稀释液液面），振摇小三角瓶或换用1支无菌吸头（4.18）反复吹打使其混合均勾，制成下一稀释度的样品勾液。按照以上操作程序，制备10倍系列稀释样品勾液。每递增稀释1次.换用1次无菌吸头（4.18）。8.3.2样品接种
8.3.2.1接种时根据样品的实际污染情况，选择2个3个合适的稀释度的样品匀液（包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平血（4.19)内.每个稀释度接种两个平血。同时分别吸取1mL空白稀释液加人两个无菌平皿（4.19）内做空白对照。8.3.2.2及时将15mL～20mL冷却至45℃±0.5℃［可放置45℃±1℃水浴箱（4.13）中保温］的CandidaElective琼脂（5.4)倾注平血，边倾注边转动平血使其混合均勾。5
HiiKAoiKAca
SN/T4656.1—2016
8.3.3培养
待琼脂凝固后，将平血翻转.倒置28C士1℃C培养48h土2h。8.3.4典型菌落计数和确认
8.3.4.1培养结束后应及时计数，可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器（4.20）。菌落计数以菌落形成单位（colony-formingunits，CFU）表示。8.3.4.2白假丝酵母菌在CandidaElective琼脂（5.4）平板上典型菌落呈深棕色小菌落，圆形凸起，边缘整齐，表面干燥成磨砂样，用无菌接种环（4.9）接触后有类似巧克力融化后的样子。8.3.4.3选择有典型或可疑白假丝酵母菌菌落的平板计数。合适的计数范围为15CFU～150CFU，原则上尽可能选择典型或可疑菌落数在合适的计数范围或接近合适的计数范围的平板，计数典型或可疑菌落数。如果：
a）只有一个稀释度两个平板的典型或可疑菌落数在15CFU～150CFU之间，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
b）最低稀释度两个平板的典型或可疑菌落数均小于15CFU，计数该稀释度两个平板上的典型或可疑菌落。
所有稀释度平板上的菌落数均大于150CFU且有典型或可疑菌落，应计数最高稀释度两个平c）
板上的典型或可疑菌落。
以上典型或可疑菌落确证后按式（1）计算。AB
式中：
样品中白假丝酵母菌菌落数：
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2；按6.1、6.3制备样品，k=1；某一稀释度两个平板典型或可疑菌落平均数；某一稀释度确证试验阳性的菌落数：某一试验中用于确证试验的菌落数；稀释因子。
两个连续稀释度平板的典型或可疑菌落数均在15CFU～150CFU之间.则这两个连续稀释d
度平板上的典型或可疑菌落都应计数。菌落确证后按式(2)计算。A,B/C/+A2B2X10/C2
式中：
样品中白假丝酵母菌菌落数：
根据样品制备方法得出的系数，按6.2制备样品，k=2：按6.1、6.3制备样品，k=1；第一稀释度（低倍稀释度）两个平板典型或可疑菌落平均数；第一稀释度(低倍稀释度)确证试验阳性的菌落数；第一稀释度（低倍稀释度）用于确证试验的菌落数：第二稀释度(高倍稀释度)两个平板典型或可疑菌落平均数；第二稀释度（高倍稀释度）确证试验阳性的菌落数：第二稀释度（高倍稀释度）用于确证试验的菌落数：稀释因子（第一稀释度）。
e）月
所有稀释度的平板上都没有典型或可菌落，则直接以小于1乘以最低稀释倍数报告结果。6
SN/T4656.1—2016
如典型或可疑菌落计数出现其他情况，可先计算同一稀释度的两个平板平均数，选择典型或可f)
疑菌落平均数在合适计数范围或接近合适计数范围的结果计数，如只有一个平均结果在计数范围内，确证后按式（1)计算结果，如两个平均结果都在计数范围内，确证后按式(2)计算。8.3.4.4一个稀释度计数结果在合适范围内情况举例参见B.1，两个稀释度计数结果都在合适范围内情况参见B.2。
8.3.4.5从可计数的平板上任意挑取典型或可疑菌落5个（小于5个全部挑取），分别按7.3.3做确证试验。
8.4结果报告
根据CandidaElective琼脂平板上典型或可疑菌落总数，按照8.3.4中公式计算，报告每平方厘米、每克或每100平方厘米样品白假丝酵母菌数，以CFU/cm2CFU/g或CFU/100cm2表示。如T值为O，则以小于1乘以最低稀释倍数报告：如T值小于100CFU，以实际数值报告：如T值大于或等于100CFU时，报告时数值按GB/T8170规则进行修约，用10的指数形式来表示，数值保留两位有效数字。
SN/T4656.1-2016
A.1培养基制备及质量保证
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂
按SN/T1538.1和SN/T1538.2.并对制备好的培养基进行性能测试，如使用等效商品化脱水合成培养基，使用前对其进行验收并按其说明书使用。A.2无菌生理盐水
A.2.1成分
氯化钠
蒸馏水
1000mL
称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。3麦芽浸膏肉汤（MEB）
A.3.1成分
麦芽浸膏
蒸馏水
1000mL
将麦芽浸膏在蒸馏水中充分溶解，滤纸过滤，调至pH4.7士0.2.分装，121℃灭菌15min。如无麦芽浸膏，可按下法制备：用饱满健壮大麦粒在温水中浸透，置温暖处发芽，幼芽长达到2mm时，沥干余水，干透，磨细使成麦芽粉。制备培养基时，取麦芽粉30g加水300mL，混勾，在60℃～70℃浸渍1h，吸出上层水。再同样加水浸渍一次，取上层水，合并两次上层水，并补加水至1000mL，滤纸过滤。调至pH4.7土0.2，分装，121℃灭菌15min。A.4念珠菌显色培养基
A.4.1成分
营养物质（蛋白陈等）
氯霉素
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