QB/T 5484-2020.Test for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants and antiseptics used in food and domestic.
QB/T 5484规定了一种检验食 品及家庭用消毒剂、杀菌剂产品杀细菌性能的试验方法。
QB/T 5484适用于评价试样原样或用水稀释可形成均匀的、物理上稳定的食品及家庭用消毒剂、杀菌剂。
QB/T 5484至少适用于以下领域的产品:
a)生产加工、分装过程和零售领域
奶和奶制品、肉和肉制品、海鲜和相关产品、蛋和蛋制品、动物饲料、饮料、水果蔬菜及其衍生物(包括糖、酒等)、面粉磨粉和烘焙物、动物饲料。
b)公共区域和家庭领域
餐饮企业、公共场所、公共交通、学校、托儿所、商店、体育室、废物容器(垃圾桶等)、宾馆、居民住所、医院临床上的非敏感区域、办公室。
c)其他行业领域
包装材料、生物技术(酵母、蛋白质、酶等)、制药学、化妆品和化妆品用具、织物、航天工业、计算机行业。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注8期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析试验 室用水规格和试验方法
SNT 1538.2培养基制备指南第2 部分:培养基性能测试实用指南
3术语和定义
下列定义适用于本文件。
3.1杀细菌活性bactericidal activity在设定条件下使相关试验菌的活菌细胞数降低的能力。
3.2洁净条件clean conditions表面经过符合要求的清洁程序，并经确认后表面包含有最低水平的有机和/或无机物残留。
3.3污染条件dirty conditions表面可能包括有机和/或无机物残留。
4方法提要
将试样原样或用水稀释后的样品加入试验菌悬液，保持混合物于确定温度下作用一定时间， 使试样的杀细菌作用被立即中和，然后确定样品中存活的细菌数，并计算活菌数减少的量，确定试样的杀细菌

ICS71.100.40
分类号：Y43
中华人民共和国轻工行业标准
QB/T5484-2020
食品及家庭用消毒剂、杀菌剂性能的杀细菌活性评估试验
Test for the evaluation of bactericidal activity of chemical disinfectants andantiseptics used in food and domestic2020-04-16发布
中华人民共和国工业和信息化部2020-10-01实施
娇意尚用国家品
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国食品用洗涤消毒产品标准化技术委员会（SAC/TC395）归口。QB/T54842020
本标准起草单位：中国日用化学研究院有限公司国家洗涤用品质量监督检验中心（太原）1、苏州世谱检测技术有限公司、表面活性剂和洗涤剂行业生产力促进中心。本标准主要起草人：公培龙、姚晨之、李晓辉、李晓婷、李晓睿、孟丽君、卢剑。本标准为首次发布。bzxz.net
1范围
QB/T5484-2020
食品及家庭用消毒剂、杀菌剂性能的杀细菌活性评估试验本标准规定了一种检验食品及家庭用消毒剂、杀菌剂产品杀细菌性能的试验方法本标准适用于评价试样原样或用水稀释可形成均匀的、物理上稳定的食品及家庭用消毒剂、杀菌剂本标准至少适用丁以下领域的产品：a）生产加工、分装过程和零售领域奶和奶制品、肉和肉制品、海鲜和相关产品、蛋和蛋制品、动物饲料、饮料、水果蔬菜及其衍生物（包括糖、酒等）、面粉磨粉和烘焙物、动物饲料。b）公共区域和家庭领域
餐饮企业、公共场所、公共交通、学校、托儿所、商店、体育室、废物容器（垃圾桶等）、宾馆、居民住所、医院临床上的非敏区域、办公室。c）其他行业领域
包装材料、生物技术（酵母、蛋白质、酶等）、制药学、化妆品和化妆品用具、织物、航天工业、计算机行业。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析试验室用水规格和试验方法SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指商3术语和定义
下列定义适用于本文件。
杀细菌活性bactericldalactivity在设定条件下使相关试验菌的活菌细胞数降低的能力。3.2
洁净条件clean conditiens
表面经过符合要求的清洁程序，并经确认后表面包含有最低水平的有机和/或无机物残留。3.3
污染条件dirtyconditions
表面可能包括有机和/或无机物残留。4方法提要
将试样原样或用水稀释后的样品加入试验菌悬液，保持混合物于确定温度下作用一定时间，使试样的杀细菌作用被立即中和，然后确定样品中存活的细菌数，并计算活菌数减少的量，确定试样的杀细菌能力。
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5材料与试剂
5.1试验菌
用以下3种菌体来评价杀菌活性：铜绿假单胞菌
大肠埃希氏菌
金黄色葡葡球菌
ATCC15442;
大肠杆菌8099或ATCC10536或ATCC25922或ATCC11229
ATCC6538.
若对特殊用途另有要求，可增选以下菌种：沙门氏菌
乳酸菌
翼大肠杆菌
ATCC13311:
DSM62351
DSM6234
若使用增加的菌种，应在最佳生长条件下（温度、时间、空气，培养基）对其进行培养，并在试验报告中注明。若这些增加的试验菌在菌种保藏中心不是保密的，则说明它们的识别特征。除此，应被试验室或菌种保藏中心自然培养保存5年。5.2培养基和试剂
5.2.1常规试剂
本标准中所有化学物质均指其无水盐，水合物形式作备用，当使用水合物形式时应调整所要求的质量。
试剂应是分析级别或适用于微生物，而且不含对试验菌有毒的或抑制作用的物质。为了提高细菌繁殖能力，应使用商业上可用的脱水材料来制备培养基，严格遵守关于这些产品制备的生产说明书。
所用水应是GB/T6682三级或以上的水，并于高压蒸汽灭菌锅内灭菌。注1：若水被用于制备培养基并随后进行火菌，则不必提前进行高压蒸汽灭菌。注2：亦可使用注射制剂用水。
5.2.3胰蛋白陈大豆琼脂（TSA）用于保藏菌种和做活菌数计数。胰蛋白陈
大豆蛋白陈
氯化钠
定容至1000mL
高压蒸汽灭菌锅内灭菌后，培养基的pH于（20土1）℃下测量应为7.2土0.2。培养基制备应符合SN/T1538.2。注：为避免中和时遇到间题，必要时可将中和剂加入TSA。5.2.4稀释液
胰蛋白陈氯化钠溶液做稀释液：胰蛋白陈
氯化钠（NaC1）
定容至1000mL
高压蒸汽灭菌锅内灭菌后，培养基的pH于（20土1）℃下测量应为7.0士0.2。5.2.5中和剂
按照附录A检验针对试验样品所用的中和剂。2
注：附录B中可以找到对一些产品适合的中和剂。5.2.6洗液（用于膜过滤法）
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对基于试验样品的洗液进行验证，结果该洗液应是无菌的，且于试验所描述的试验条件下，与所用滤膜相符并具有透过滤膜的过滤能力注：在附录C中可以找到对
5.2.7硬水（用于产品稀释
些产品适合的洗液相关信息
溶液A：溶解19.84g无水MgCl和46.24g无水CaCl2于水中，稀释至1000mL。该溶液应在4℃~8℃下保存，最长保留时间为1个。溶液B：溶解35.02gNaHQ0于水中，稀释至000mL，该溶液应在4℃~8C下保存，最长保留时间为1个星期
加600mL水至含6.0mL溶液A的1000mL容量瓶中然后再加入8.0mL溶液B，用水稀释至1000mL。在（20±1）C条件下，pH应为7.0±0.2，必要时可以用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节。
硬水应该在无菌环境下配置，
5.2.8干扰物
5.2.8.1常规干扰物
使用有效孔径不超过0.45um的过滤器过滤，并在12h内使用。离子组分（PH、钙镁硬度）和化学组分（矿物质、蛋白质、糖类、脂质类、洗涤剂等）均需全部定量。
根据产品规定的使用条件选择干扰物。干扰物应是无菌的，在试验中要配制10倍于其最后使用浓度的干扰物。在试验报告中应注明配制和消毒的方法以及组分。5.2.8.2牛血清白蛋白溶液
5.2.8.2.1用于洁净环境
溶解牛血清白蛋白0.30g于100mL的水中，通过膜过滤法除菌，最终测试时的牛血清白蛋白浓度为0.3g/L
5.2.8.2.2用于污染环境
溶解牛血清白蛋者3.00g于100mL的水中，通过膜过滤法灭菌：最终测试时的牛血清白蛋白浓度为3g/L。
5.2.8.3乳液（乳品店、牛奶工业）由100g确保无抗生素或添加剂的脱脂奶粉，加1L水济解而成的复原乳溶液，制备如下：在水中配制体积分数为10.0%的复原乳落液，于（105土3）℃下灭菌30min或（121土3）℃下灭菌5min，得到的复原乳溶液最终浓度为1.0%（体积分数）。5.2.8.4酵母提取物（酿酒厂
酵母提取物，制备如下：
用氢氧化钠调PH至7.0土0.2，于高压灭菌锅内灭菌。最终使用的酵母提取配制100g/L水洛液，
物浓度为10gL。
5.2.8.5燕糖（饮料，不含酒精的饮料行业）配制100gL蔗糖水溶液，然后用膜过滤法灭菌。最终使用的蔗糖浓度为10g/L。5.2.8.8为5.0和为9.0的缓冲溶液（原位清洗）在试验报告中应描述所使用的缓冲溶液及其pH。测试中最终的pH应为5.0士0.2或9.0士0.2。5.2.8.7月桂基硫酸钠（化妆品工业）配制50g/L的月桂基硫酸钠水溶液，经高压火菌锅灭菌。最终使用的月桂基硫酸钠浓度为5g/工。3
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6设备和玻璃用品
6.1常用的微生物试验设备及特殊设备6.1.1灭菌设备
对于湿热灭菌法，高压灭菌锅在（121二3》C下最短保留时间为15mim对于干热灭菌法，
，干热灭菌器在（180士5）
保留时间为1h，或在（160
6.1.2水浴锅
能控制在（20±1）℃
±1℃。
6.1.3培养箱
@下最短保留时间为30mim，或在（170士5）℃下最短℃下最短保留时间为2五
（45士1）℃用以保持溶化的TSA可倾注于平Ⅲ）以及增加的试验温度能控制在（36±1）℃或371）℃。6. 1. 4 pH计
（20±1）℃下，精度为01p。
注：使用穿孔电极或膜电极测量琼脂培养基的pH。6.1.5秒表
6.1.6涡流搅拌器
电动搅拌器或机械振动器
6.1.7过滤器
由与待过滤的物质相符的材料组成，应配备容积不小于50mL的接液器。径为47mm~50mm，孔径为0.45um
提供稳定的过滤流量，在20s~40s得到100m过滤液，使微生物均匀分有在膜上6.1.8冰箱
能控制在2℃~8℃
6.1.9吸管
0.1mL、1mL和10mL，或带有刻度的自动吸管或数字可调移液器及配套用一次性塑料吸头。
6.1.10培养血
直径为90mm
6.2玻璃用品
6.2.1玻璃珠
100mm1r带盖
粒径3mm~4mm
6.2.2容器
试管或适当容量的烧瓶、睿量瓶、锥形瓶。7细菌悬液和试验溶液的制备
7.1细菌悬液
7.1.1试验菌的肉汤培养基
肉汤培养基应符合所用菌种的培养条件7.1.2试验菌的工作培养物
为制备试验菌的工作培养物，将源于肉汤培养基的培养物接种于TSA斜面或平皿，并培养得到第1代培养物。18h～24h后，用同样的方法由第1代培养物制备第2代培养物，并培养18h~~24h。以同样的方法，由第2代培养物制备第3代培养物。第2代和第3代培养物为工作培养物。若在特定时间未得到第2代培养物，在随后的传代中可采用48五的培养物，即将次培养物保留在4
培养箱48h。
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对于增加的菌种，在试验报告中应注明任何相对于培养细菌或制备悬浮液的方法所存在的偏差，并给出理由。
7.1.3试验菌悬液
取10mL稀释剂，置于含适量玻璃珠的100mL锥形瓶内，用接种环取数环工作培养菌至稀释剂中。接种环在锥形瓶壁与液面接触处涂抹以便移出菌，使细菌分散在稀释剂中。用机械振动器振摇锥形瓶3min。吸取锥形瓶中的悬液，移至另一试管。用稀释液调整悬液中菌数为1.5×105CFU/mL～5×105CFU/mL，用任一适用的方法估测其CFU数。保持悬液恒温于试验温度（6士1）℃的水浴锅中，并于2 h内使用。
用分光光度计调整细菌数（波长约620nm，口径长为10mm的比色管）因此每一实验室应对每一种试验菌进行数据校准，从而得到适合的光密度值，一般在0.150与0.460之间找到合适的数据。也可选用细菌浊度仪调整菌液浓度。用稀释剂制备试验悬液的103和10-稀释液，以便做试验菌悬液计数。混匀。各取每种稀释液1.0mL两份，将每1.0mL样品稀释液移至不同的培养皿内，加入15mL20mL冷却至（45士1）℃的TSA。7.1.4试验菌悬液计数（N）
于（36土1）℃或（37士1）℃下培养平血48h。先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大510倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平血生长的平均菌落数。若平血中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平血不宜计数。若片状菌落不到平血中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平血菌落计数后乘以2，以代表全Ⅲ菌落数。确定每一平Ⅲ的最高菌落数Ve。用所给的方法计算试验菌悬菌落数（N）。7.2试验产品溶液
现配试验产品溶液及其稀释液，并在1h内使用。若产品的稳定性较低，应缩短该时间。在硬水中配制3个不同浓度的试验样品，其中包括活性范围的一浓度和非活性范围的一浓度。配制用于试验产品溶液的浓度应是该产品要求的试验浓度的1.25倍。对于固体产品，至少称取1g土10mg产品于容量瓶中，并用硬水使其落解。在容量瓶中，以体积比的形式用硬水制备随后的稀释液。对于液体产品，在容量瓶中，以体积比的形式用硬水制备产品稀释液。对于备用的产品，用水制备稀释液。当用硬水稀释产品时，稀释液应在物理上是均相稳定的。8试验步骤
8.1试验条件的选择
依据产品的实际应用，选择作用温度、作用时间和干扰物。a）作用温度（以℃表示）：
必需测试温度为20℃；
一增加的温度可从4℃、10℃或40℃中选择：每一所选温度允许偏离的范围为土1℃。b）作用时问（以min表示）：
必需测试时间为5min；
增加的作用时间可从1min、15min30min或60min中选择，也可根据产品的实际使用情况选择测试时间：
每一所选作用时间允许偏离的范围为三10s（1min允许偏差为士5s）。c）试验菌种：
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-5.1描述的菌种。
d）干扰物：
根据实际用途，试验干扰物为洁净条件（0.3g/L的牛血清白蛋白）或污染条件（3gL的牛血清白蛋白）下的牛血清白蛋白溶液；一在其他要求的情况下，应根据产品的具体应用领域来选择干扰物；一在试验使用条件下，产品不应引起任何沉淀物的形成。8.2评估产品杀菌效果的试验程序8.2.1试验方法的选择
所选方法为稀释-中和法时应确定合适的中和剂，使用种中和剂进行稀释-中和法的证实试验，其中可根据试验经验和已公布的数据选择中和剂。若该中和剂未被证实，则在稀释液或0.0025mol/L磷酸盐缓冲液中用选择范畴中的中和剂重复证实试验，其中可用中和剂包括以下组合，即30g/L的叶温80、30g/L的皂角苷、1g/L的L-组氨酸、3g/L的卵磷脂、5 g/L的硫代硫酸钠。若两种中和剂均术被证实，可采用膜过滤法代替稀释-中和法。注：特殊情况下，有必要将TSA中加入中和剂，8.2.2稀释-中和法
8.2.2.1常规条件
试验前，使用水浴将所有试剂（试样溶液，试验菌悬液，验证菌悬液，稀释剂，水）平衡到试验温度。检验所有试剂的温度，使其稳定在试验温度。中和剂、洗液和水应恒温于（20士1）℃。8.2.2.2产品杀菌活性的试验步骤用吸管移取干扰物1.0mL至试管中，加入含1.5×108CFU/mL~5×10%CFU/mL的一种试验菌悬液1.0mL。若为食品及家庭清洁产品，加入含1.5×105CFU/mL~5×105CFU/mL的一种试验菌悬液1.0mL。立即开始计时，混匀并将试管放入水浴中，于要求的试验温度下恒温2min士10s。该时间结束后，立即加入产品试验忌液8.0mL。再次开始计时，混匀并将试管放入水浴中，于试验温度下作用试验时间±10s。
注：当加入菌悬液时，注意避免接触到试管壁的上部。在作用时间结束前，混匀。作用时间结束时，移取试验混合物1.0mL至含8.0mL中和剂和1.0mL水的试管内。混勾并置于水浴中，恒温在（20土1）C。中和10min土10s后，立即分取两份1.0mL中和混合物样品（中和剂、产品试验溶液、干扰物、试验菌悬液），将每1.0mL样品液移至不间的培养皿中，并迅速加入15mL～20mL冷却至（45土1）℃的TSA。
8.2.2.3试验混合物计数
于（36士1）℃或（37土1）℃下，培养平血20h～24h，弃去任何不可计数的平。做平血计数，确定菌落形成单位数。再培养平Ⅲ20h～24h，不再对不能形成明显分离菌落的平血计数，对剩下的平计数。确定每一平血的最高菌落数Ve。计算试验混合物菌落数（Na）。8.2.3膜过滤法
8.2.3.1常规条件
在试验前，于控制温度在（A士1）℃C的水浴锅中，使所有试剂（试验产品溶液、试验菌悬液、干扰物）恒温至测试温度（0士1）℃。使中和剂和水恒温在（20土1）℃。8.2.3.2产品杀菌活性的试验步骤用吸管移取1.0mLT扰物至试管内，加入其中一种试验菌悬液1.0mL。立即开始计时，混匀，并将试管置于水浴中，于（士1）C恒温2min士10s。该时间段结束后，6
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加入其中一种产品试验溶液8.0mL。再次开始计时，混匀，并将试管置于水浴中，于（6士1）℃恒温适当的作用时间（t士10）S。
在所选的作用时间结束前，混匀。在所选的作用时间内，吸取两份1.0mL的样品试验混合物，并将每份样品移至不同的带有薄膜和含50mL洗液的膜过滤装置内，立即过滤。要求转移和过滤的时间不应超过1min。若大于1min，应在试验报告中记录此时间。清洗时应用至少150mL的洗液，但不应大于500mL。若洗液不是水，就再过滤50mL水完成过滤。然后将薄膜移至2个不同的TSA平血的表面培养计数。在特殊情况下，可将中和剂加入TSA中。注：转移期间，当将薄膜置于TSA上时，注意保证薄膜上含细菌一面朔上，而且避免将空气引入薄膜和琼脂之间。8.2.3.3试验混合物计数
于（36±1）C或（37土1）C培养平血24h。弃去任何不可计数的平Ⅲ。做平血计数，确定每一平血的菌落形成单位数。再培养平Ⅲ24h。对未明显分离菌落的平Ⅲ不进行进行计数。对剩下的平血再次计数。确定每一平Ⅲ的最高菌落数V。应用所给出的方法计算试验混合菌落数（Na）。8.3稀释-中和法和膜过滤法的证实按照附录A，对涉及试验的中和剂或洗液、干扰物、硬水和试验条件来进行验证。9计算和结果的表达
9.1菌落数（CFU/mL）的计算
9.1.1试验菌悬液
试验菌悬液的计数：
只有少于300CFU/mL的平血的才能用来计算菌落数。至少应有一个平血包括15CFU或更多菌落！至少应用两个平血来计算菌落数，其中一个或两个平皿包括多于的菌落，而且两个平血所含菌落均应少于300CFU。若两个稀释度的平血菌落数都在15CFU～300CFU范围，就按加权平均数来计算菌落数。若只有一个稀释度的平血属于该范圈，就计算其算术平均数用公式（1）计算加权平均数：
式中：
N—试验菌悬液菌落加权平均数：c
(ni+o.lna)d
e—所考虑的所有平板上菌落数的总和；n1——所考虑的第一稀释液的平血数；m2——所考虑的第二稀释液的平Ⅲ数；d所考虑的与第一稀释液相应的稀释因子。.1)
修约方式为，四舍六入五留双。将计算结果修约至两位有效数字，用科学计数法来表达。示例
168+215+14+25
6~1.9182×10 1.9×108 (CFU/mL)(2+0.1×2)10-62.2×10-6
9.1.2试验步骤和证实试验菌落计数每个平Ⅲ菌落数少于300CFU才可用来计算菌落数。应使用两个平血的菌落数来计算。当至少有1个平Ⅲ包括15个或更多菌落时，按公式（2）计算菌落数（CFU/mL）：7
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式中：
Na试验混合物的菌落数；
C——所考虑的所有平板上菌落数的总和；所考虑的平板数；
d一与所考虑的稀释液相应的稀释因子；C
V样品体积。对于稀释-中和法，样品体积为1.0mL。对于膜过滤试验，样品体积为0.1mL。当所有计数平板的CFU数小于15，应报告小于1.5×102CFU/mL（<1.5x102CFU/mL）的试验混合物的活菌数。当所有计数平板的CFU大于300，应报告大于3×103CFU/mL（>3×103CFU/mL）的试验混合物的活菌数。
9.2方法证实试验的菌落计数
对于每种试验材料，其菌落数应符合：a）N在1.5x108CFU/mL~5x10%CFU/mL范围内（食品及家庭清洁产品N在1.5×105CFU/mL~5×105CFU/mL范围内）：
b）Ny在6x102CFU/mL~3×103CFU/mL范围内）A和B不小于Nv的0.05倍
d）C不小于B的0.5倍。
其中：
N是试验菌悬液的菌落数；
Ny是验证菌悬液的菌落数；
A是证实试验条件的菌落数；
B是证实中和剂毒性或过滤控制程序的菌落数；C是证实稀释-中和法或膜过滤试验的菌落数。9.3结果的表达
对于每一试验菌种，记录试验菌悬液的茵落数（N）和产品杀菌活性试验程序结束后的菌落数（Na）。对于中和作用的验证，记录菌悬液的菌落数（Nv）。对于稀释-中和法的验证，记录稀释-中和法的菌落数（B）和稀释中和作用控制的菌落数（C）。对于膜过滤法的证实，记录过滤控制的菌落数（B）和过滤试验控制的菌落数（C）。在每一产品浓度及每一试验条件下，用公式（3）分别计算并记录对数值减少量R：R=Nx10-1
10结论
....(3)
在要求的试验条件下以及当试验菌是铜绿假单胞菌、大肠坎希氏菌、金黄色葡萄球菌时，已经证明了细菌的生存能力会降低105（以菌落数值的减少量R计）或更多，试验条件为：5min士10s、（20士1）C和洁净条件或污染条件，说明试验产品在该试验浓度下具有杀细菌活性。对于食品及家庭用清洁产品，在要求的试验条件下以及当试验菌是大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌时，已经证明了细菌的生存能力会降低103（以菌落数值的减少量R计）或更多，其中试验条件为：5min士10s、（20士1）°C和洁净条件的试验条件下，说明试验产品在该试验浓度下具有杀细菌活性。8
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