SN/T 5361—2021
基本信息
标准号： SN/T 5361—2021
中文名称：出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法 f usA基因测序法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 5361—2021.
1范围
SN/T 5361规定了出口食品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法。
SN/T 5361适用于出口食品中阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sa kazakii)的检测。
SN/T 5361也适用于出口食品中克罗诺杆菌属其他六个种,分别为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌（Cronobacter turicensis)、穆汀斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)、都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis )、尤尼沃斯克罗诺杆菌(Cronobacter universalis)和康帝蒙提克罗诺杆菌(Cronobact er condimenti)的检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验―克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安全通用要求
GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1管家基因lh ouse--kceping gene
其是所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。其又称看家基因,持家基因。
3.2Taq DNA酶Thermus aquaticus DNA polymerase
其是从Thermus aquaticus 细菌中提取的耐热1DNA聚合酶。
3.3多位点序列分型multilocus sequence typing
其是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列以分析菌株的差异。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHI:脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth);
1范围
SN/T 5361规定了出口食品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法。
SN/T 5361适用于出口食品中阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sa kazakii)的检测。
SN/T 5361也适用于出口食品中克罗诺杆菌属其他六个种,分别为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌(Cronobacter malonaticus)、苏黎世克罗诺杆菌（Cronobacter turicensis)、穆汀斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)、都柏林克罗诺杆菌(Cronobacter dublinensis )、尤尼沃斯克罗诺杆菌(Cronobacter universalis)和康帝蒙提克罗诺杆菌(Cronobact er condimenti)的检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验―克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安全通用要求
GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1管家基因lh ouse--kceping gene
其是所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。其又称看家基因,持家基因。
3.2Taq DNA酶Thermus aquaticus DNA polymerase
其是从Thermus aquaticus 细菌中提取的耐热1DNA聚合酶。
3.3多位点序列分型multilocus sequence typing
其是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通过PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列以分析菌株的差异。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHI:脑心浸出液肉汤(brain heart infusion broth);
标准图片预览
标准内容
ICS07.100.30
CCSX 04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5361—2021
出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法fusA基因测序法
Detection of Cronobacter sakazakii in export food fusA gene sequencing method2021-11-22发布
中华人民共和国海关总署
2022-06-01实施
以正式出版文本为准
中华人民共和国出人境检验检疫泰行业标准
出口食品中际崎克罗诺杆菌检测方法务平台
基因测序法
SN/T 361-2021
中国海关由版社有限公司门发发有区编辑部：（010)65194242-7509
网址customskb.com/book
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.5字数15千字
2022年6月第一版2022年6月第一次印刷印数1—500
书号：155175·730
定价8.00元
SN/T5361—2021
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心。本文件主要起草人：汪琦、曾静、徐蕾蕊、付溥博、赵晓娟、李丹、马丹、魏海燕、王紫薇、张西萌。1范围
出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法fusA基因测序法
本文件规定了出口食品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法。本文件适用于出口食品中崎克罗诺杆菌（Cronobactersakazakii）的检测SN/T5361—2021
本文件也适用于出口食品中克罗诺杆菌属其他六个种，分别为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（Cronobactermalonaticus）、苏黎世克罗诺杆菌（Cronobacterturicensis）、穆汀斯克罗诺杆菌（Cronobactermuytjensii）、都柏林克罗诺杆菌（Cronobacterdublinensis）、尤尼沃斯克罗诺杆菌（Cronobacteruniversalis）和康帝蒙提克罗诺杆菌（Cronobactercondimenti）的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义运用宁本文件
3.1管家基因ouse-repinggene
其是所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达其文称看家基因，持家基因。3.2TaqDNA酶ThermusaquaticuNArolymerase其是从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热!NA聚合酶。3.3多位点序列分型multilocussequencetyping服务平台
其是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列以分析菌株的差异。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHI：脑心浸出液肉汤（brainheartinfusionbroth）；DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid)；dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）；EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid)；SN/T5361—2021bzxz.net
fusA：延长因子G基因（elongationfactorG）；GTP：三磷酸鸟苷（guanosinetriphosphate）；MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）；PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。5原理
fusA基因是细菌延长因子的编码基因。在克罗诺杆菌属细菌中负责编码延长因子G，该因子在翻译延长过程中催化GTP依赖的核糖体的转运。fusA基因是克罗诺杆菌属MLST分型使用的七个管家基因之一，其基因的序列对克罗诺杆菌属的分类效果好，相同的fusA基因序列基本不会同时存在于两种克罗诺杆菌中。因此，可利用该基因片段的序列信息区分克罗诺杆菌属的不同种。文的
6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1ExTaqDNA聚合酶。
6.2dNTP:dATP.dTTP.dCTP,dGTP.6.3DNA提取试剂：DNA提取试剂盒6.410XExTaq缓中液。
6.5MgClz溶液（25mmol/L）。
mmol/LEDTA(pH8.0)
6.7琼脂糖。
6.850XTAE缓冲液:2mol/LTris-HCl(pH8.4).1mol/L酸,0.1mol/LEDTA6.9DNA分子量标记物（100bp~2000bp）。参考菌株：阪崎克罗诺杆菌ATCC29544。6.10
行业标准信息服务平台
仪器和设备
7.1PCR扩增仪。
电泳仪。
凝胶成像系统。
离心机：离心力不小于12000g。7.5恒温培养箱：36℃土1℃。
7.6恒温水浴锅：44℃士0.5℃。微量移液器和无菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。7.7
7.8天平：感量为0.1g。
灭菌三角烧瓶：500mL、250mL。7.10
灭菌平皿：90mmX15mm。
无菌离心管：1.5mL、200μL。
检测步骤
样品制备、增菌培养和分离
样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB4789.40的方法进行。模板DNA的制备
SN/T5361—2021
取分离菌株BHI液体培养物适量，加到1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心5min，吸弃上清，加50uLTE缓冲液，混匀后沸水浴10min，13000r/min离心5min，上清液用于后续实验。也可使用商业化的DNA提取试剂盒，并按其说明制备模板DNA。8.3PCR反应体系
8.3.1PCR扩增和测序引物序列
版文本为准
扩增正向引物：5'-GAAACCGTATGGCGTCAG-3'；扩增反向引物：5'-AGAACCGAAGTGCAGACG-3；测序正向引物：5'-GCTGGATGCGGTAATTGA-3”测序反向引物：5'-CCCATACCAGCGATGATG-3PCR反应体系
见表1。
表1PCR反应体系
双蒸水
10×PCR缓冲液
上游引物
下游引物
Taq酶
模板DNA
此备液浓度
25mmol/L
Le.5m/nol/L.each
Jopnoi/4
10pmol/ml
5U/μL
加样体积/uL
补至50l
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行当调整8.3.3
反应条件
终浓度
1.5mmol/L
0.2mmol/1.each
0.4pmol/μL
0.4pmol/μL
0.05U/μL
96℃预变性1min；96℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，30，值环；72℃延伸5min；4℃保存反应产物。
注：PCR反应参数也可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为阪崎克罗诺杆菌参考菌株ATCC29544的基因组DNA，空白对照为无菌水。
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CCSX 04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5361—2021
出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法fusA基因测序法
Detection of Cronobacter sakazakii in export food fusA gene sequencing method2021-11-22发布
中华人民共和国海关总署
2022-06-01实施
以正式出版文本为准
中华人民共和国出人境检验检疫泰行业标准
出口食品中际崎克罗诺杆菌检测方法务平台
基因测序法
SN/T 361-2021
中国海关由版社有限公司门发发有区编辑部：（010)65194242-7509
网址customskb.com/book
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张0.5字数15千字
2022年6月第一版2022年6月第一次印刷印数1—500
书号：155175·730
定价8.00元
SN/T5361—2021
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心。本文件主要起草人：汪琦、曾静、徐蕾蕊、付溥博、赵晓娟、李丹、马丹、魏海燕、王紫薇、张西萌。1范围
出口食品中阪崎克罗诺杆菌检测方法fusA基因测序法
本文件规定了出口食品中阪崎克罗诺杆菌的检测方法。本文件适用于出口食品中崎克罗诺杆菌（Cronobactersakazakii）的检测SN/T5361—2021
本文件也适用于出口食品中克罗诺杆菌属其他六个种，分别为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌（Cronobactermalonaticus）、苏黎世克罗诺杆菌（Cronobacterturicensis）、穆汀斯克罗诺杆菌（Cronobactermuytjensii）、都柏林克罗诺杆菌（Cronobacterdublinensis）、尤尼沃斯克罗诺杆菌（Cronobacteruniversalis）和康帝蒙提克罗诺杆菌（Cronobactercondimenti）的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义运用宁本文件
3.1管家基因ouse-repinggene
其是所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达其文称看家基因，持家基因。3.2TaqDNA酶ThermusaquaticuNArolymerase其是从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热!NA聚合酶。3.3多位点序列分型multilocussequencetyping服务平台
其是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法。这种方法通PCR扩增多个管家基因内部片段并测定其序列以分析菌株的差异。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHI：脑心浸出液肉汤（brainheartinfusionbroth）；DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid)；dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）；EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid)；SN/T5361—2021bzxz.net
fusA：延长因子G基因（elongationfactorG）；GTP：三磷酸鸟苷（guanosinetriphosphate）；MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）；PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。5原理
fusA基因是细菌延长因子的编码基因。在克罗诺杆菌属细菌中负责编码延长因子G，该因子在翻译延长过程中催化GTP依赖的核糖体的转运。fusA基因是克罗诺杆菌属MLST分型使用的七个管家基因之一，其基因的序列对克罗诺杆菌属的分类效果好，相同的fusA基因序列基本不会同时存在于两种克罗诺杆菌中。因此，可利用该基因片段的序列信息区分克罗诺杆菌属的不同种。文的
6试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1ExTaqDNA聚合酶。
6.2dNTP:dATP.dTTP.dCTP,dGTP.6.3DNA提取试剂：DNA提取试剂盒6.410XExTaq缓中液。
6.5MgClz溶液（25mmol/L）。
mmol/LEDTA(pH8.0)
6.7琼脂糖。
6.850XTAE缓冲液:2mol/LTris-HCl(pH8.4).1mol/L酸,0.1mol/LEDTA6.9DNA分子量标记物（100bp~2000bp）。参考菌株：阪崎克罗诺杆菌ATCC29544。6.10
行业标准信息服务平台
仪器和设备
7.1PCR扩增仪。
电泳仪。
凝胶成像系统。
离心机：离心力不小于12000g。7.5恒温培养箱：36℃土1℃。
7.6恒温水浴锅：44℃士0.5℃。微量移液器和无菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。7.7
7.8天平：感量为0.1g。
灭菌三角烧瓶：500mL、250mL。7.10
灭菌平皿：90mmX15mm。
无菌离心管：1.5mL、200μL。
检测步骤
样品制备、增菌培养和分离
样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB4789.40的方法进行。模板DNA的制备
SN/T5361—2021
取分离菌株BHI液体培养物适量，加到1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心5min，吸弃上清，加50uLTE缓冲液，混匀后沸水浴10min，13000r/min离心5min，上清液用于后续实验。也可使用商业化的DNA提取试剂盒，并按其说明制备模板DNA。8.3PCR反应体系
8.3.1PCR扩增和测序引物序列
版文本为准
扩增正向引物：5'-GAAACCGTATGGCGTCAG-3'；扩增反向引物：5'-AGAACCGAAGTGCAGACG-3；测序正向引物：5'-GCTGGATGCGGTAATTGA-3”测序反向引物：5'-CCCATACCAGCGATGATG-3PCR反应体系
见表1。
表1PCR反应体系
双蒸水
10×PCR缓冲液
上游引物
下游引物
Taq酶
模板DNA
此备液浓度
25mmol/L
Le.5m/nol/L.each
Jopnoi/4
10pmol/ml
5U/μL
加样体积/uL
补至50l
注：反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行当调整8.3.3
反应条件
终浓度
1.5mmol/L
0.2mmol/1.each
0.4pmol/μL
0.4pmol/μL
0.05U/μL
96℃预变性1min；96℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸2min，30，值环；72℃延伸5min；4℃保存反应产物。
注：PCR反应参数也可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为阪崎克罗诺杆菌参考菌株ATCC29544的基因组DNA，空白对照为无菌水。
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