ICS07.100.30 CCSW04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5364.1—2021 出口食品中致病菌检测方法 微滴式数字PCR法 第1部分：副溶血性弧菌 Droplet digital PCR method for detection of pathogens in export food - Part 1: Vibrio parahaemolyticus 2021-11-22 发布 2022-06-01 实施 中华人民共和国海关总署 发布 前言 SN/T5364.1—2021 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》起草。微滴式数字PCR法共分为8个部分：第1部分副溶血性弧菌；第2部分霍乱弧菌；第3部分溶藻弧菌；第4部分创伤弧菌；第5部分金黄色葡萄球菌；第6部分单核细胞增生李斯特氏菌；第7部分产志贺毒素大肠埃希氏菌；第8部分克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）。本文件为 SN/T5364—2021 的第1部分。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件发布机构不承担专利识别责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口，起草单位：中国海关科学技术研究中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津海关。主要起草人：曾静、魏海燕、马丹、魏咏新、李丹、徐蕾蕊、张西萌、王紫薇、董志珍、高飞、赵良娟、邢仕歌。 1 范围 本文件规定了食品中副溶血性弧菌的微滴式数字PCR检测方法，适用于食品中副溶血性弧菌的快速定性检测。检出限为1 CFU/25g~5 CFU/25g 或 1 CFU/25mL~5 CFU/25mL。 2 规范性引用文件 下列文件通过文中规范性引用构成本文件必不可少的条款：GB 4789.7《食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》、GB/T 6682《分析实验室用水规格和试验方法》、GB/T 27403—2008《实验室质量控制规范》、食品分子生物学检测术语和定义。 3 术语与定义 本文件未规定需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件： blaCARB（CARB-type beta-lactamase gene）：CARB型β-内酰胺酶编码基因 DNA（deoxyribonucleic acid）：脱氧核糖核酸 ddPCR（droplet digital polymerase chain reaction）：微滴式数字PCR 5 方法原理 针对副溶血性弧菌 β-内酰胺酶编码基因（blaCARB）保守序列设计引物和探针，将一定浓度的引物、探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合，配制成PCR反应体系。将该体系分布到10000～20000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子数量为1或0，然后进行PCR扩增。blaCARB基因探针5端标记FAM荧光基团，通过数字PCR系统的检测通道对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号增强，形成阳性微滴簇，最终根据阳性微滴判定样品中是否含有副溶血性弧菌。 6 主要设备及耗材 6.1 天平：感量0.1 g 6.2 均质器 6.3 恒温培养箱：36℃±1℃ 6.4 高速台式冷冻离心机（离心力12000g） 6.5 涡旋振荡仪 6.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6.7 生物安全柜 6.8 ddPCR扩增仪及相关配套设备 6.9 不同量程移液器：100 μL~1000 μL、20 μL~200 μL、10 μL~100 μL、0.5 μL~10 μL 6.10 离心管：2 mL、1.5 mL和0.2 mL 7 材料与试剂 7.1 仅使用分析纯试剂和符合 GB/T 6682 规定的一级水 7.2 细菌基因组提取试剂盒 7.3 ddPCR反应配套试剂 7.4 去游离核酸酶 7.5 阳性对照：副溶血性弧菌标准菌株DNA或含目的片段的DNA 7.6 副溶血性弧菌 β-内酰胺酶编码基因（blaCARB）特异性序列片段（附录A），引物探针如下：VP-F: 5′-GTGAAGCCGCCATGTTGAT-3′，VP-R: 5′-GACCACCAATTTCATTTAGCACTAAG-3′，VP-P: 5′-FAM-AGCGACAACACCGCCGCGA-BHQ1-3′ 8 检测程序 详细操作程序按照实验室标准操作规范执行，包括样品预处理、DNA提取、ddPCR反应体系配制、微滴生成、PCR扩增、荧光信号采集及数据分析。