SN/T 5364.2—2021.
1范围
SN/T 5364.2规定了食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的快速定性检测。
SN/T 5364.2的检出限为1 CFU/25 g~5 CFU/25 g(或1CFU/25 mL~5 CFU/25 mL)。
规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T 1022进出口食品中霍乱弧菌检验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA( dcoxyribonuleic acid):脱氧核糖核酸。
ddPCR(droplet digital poly merase chain reaction):微滴式数字PCR。
gbpA(GlcNAc-binding protein gene);N-乙酰葡糖胺结合蛋白A的编码基因。PCR(poly merase chain reaction):;聚合酶链式反应。
tcp A( toxin coregulated pilin gene):毒力协同调节菌毛编冯基因。
5方法原理
分别针对霍乱弧菌种属特异性gbpA基因及毒力基因tc pA设计引物/探针,将一定浓度的引物、探针与模板 DNA及数字PCR反应预混液混合﹐配成双重数字PCR反应体系。将该双重数字PCR 体

ICS 07.100.30
CCS X 04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5364.2—2021
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第2部分：霍乱弧菌
业标准信息服务平台
Droplet digital PCR method for detection of pathogens in export food-Part2:Vibriocholerae
2021-11-22发布
2022-06-01实施
中华人民共和国海关总署
SN/T5364.2-—2021
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
SN/T5364一2021《出口食品中致病菌检测方法微滴式数字PCR法》共分为8个部分第1部分：副溶血性弧菌
第2部分：霍乱弧菌
第3部分：溶藻弧菌
第4部分：创伤弧菌
第5部分：金黄色葡萄球菌
第6部分：单核细胞增生李斯特氏菌第7部分：产志贺毒素大肠埃希氏菌第8部分：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）本文件为SN/T5364一2021的第2部分为准
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、中华人民共和国天津海关、中国检验检疫科学研究院
本文件主要起草人：魏海燕、马丹、魏咏新、李丹、张西萌、徐蕾蕊、刘莉、曹佳悦、曾静、董志珍、邢任歌、赵良娟、高飞。
1范围
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第2部分：霍乱弧菌
SN/T5364.2—2021
本文件规定了食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的微滴式数字PCR检测方法本文件适用于食品中总霍乱弧菌和含毒力基因霍乱弧菌的快速定性检测，本文件的检出限为1CFU/25g～5CFU/25g（或1CFU/25mL~5CFU/25mL）。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1022进出口食品中霍乱弧菌检验方法术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义行业标
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA（deoxyribonuleicacid）：脱氧核糖酸。ddPCR（dropletdigitalpolymerasechainreaetion）：微滴式数字PCRgbpA（GlcNAc-bindingproteingene）：N-乙酰葡糖胺合蛋白A的编码基因。PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应。tcpA（toxincoregulatedpilingene）：毒力协同调节菌毛编基因5方法原理
分别针对霍乱弧菌种属特异性gbpA基因及毒力基因tcpA设计引物/探针，将一定浓度的引物、探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合，配成双重数字PCR反应体系。将该双重数字PCR体系分布到10000～20000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或0.然后进行PCR扩增。gbpA基因及tcpA基因探针5'端分别标记FAM和VIC荧光基团，利用数字PCR系统的双通道检测，可同时对两个基因的荧光信号进行采集分析。根据gbpA基因及tcpA基因所对应的阳性微滴1
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的有无判定样品中是否含有霍乱弧菌和含毒力基因的霍乱弧菌。6主要设备及耗材
6.1天平：感量0.1g。
6.2均质器。
6.3恒温培养箱：36℃±1℃。
高速台式冷冻离心机（离心力12000g）。6.4
6.5涡旋振荡仪。
6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计6.7生物安全柜。
6.8ddPCR扩增仪及相关配套设备。6.9不同量程移液器：100μ~1000μ、20~200μ10μ~100μL0.5μ~10μ版文本为准
离心管2mL、1.5mL和0.2mL。
：材料与试剂
7.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水7.2细菌基因组提取试剂盒。
7.3ddPCR反应配套试剂。
7.4去游离核酸酶：伯乐）。
7.5阳性对照：霍乱弧菌参照菌株DNA，或含目的片段的DNA亦可。7.6霍乱弧菌N-乙酰葡糖胺结合蛋白A的编码基因（gbpA)序列片段参见附录A.1,引物探针如下：gbpA-F:5'-CAAACCAAACTGGAACCCAAA-3；gbpA-R：5'-TCAACGACACAGAACGGATTG-3'；gbpA-P:5'-FAM-CCATTGTCGCGTGATGCATTTGACC-BHQ1-3\7.7霍乱弧菌毒力协同周节菌毛编码基因（tcpA)序列片段参见附录A.2.引物探针如下：tcPA-F:5'-GGGATATGTTTCCATTTATCAACGT-3';tcPA-R:5'-GCGACACTCGTTTCAAATCA-3';准信息服务平台
tcPA-P:5'-FAM-TGCTTTCGCTGCTOTCGCTGATCTT-BHQ1-3。8检测程序
食品中霍乱弧菌ddPCR检测程序见图1。1）给出这一信息是为了方便本文件使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。
衍测释品
参照SN1022进行品制备和选择性增菌细菌DVA提取
kIPCR反应
传统方法窃认
代出版？
图1食品中霍乱弧菌ddPCR检测程序实验操作步骤
9.1样品制备
参照SN/T1022中方法进行样品制备和第一次选择性增菌。9.2
DNA提取
SN/T5364.2—2021
直接取9.1获得的增菌漫2mL加到无菌离心管中，8000g离心2min.尽量吸弃上清；利用100μL磷酸盐缓冲液重悬况充.加20μL去游离核酸酶.置于37℃作用15min~30min.95℃加热10min使酶失活。继而利用细菌基因组提取试剂盒提取DNA，操作方法按试剂盒说明书进行。9.3DNA浓度和纯度测定
感服务平台
取适量DNA原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核需蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸收值，按照式（1)计算DNA的浓度。0=A260XNX50
式中：
-DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）：-260nm处的吸光值；
核酸稀释倍数。
当DNA浓度为0.1uμg/mL～100μg/mL，A260/A28在1.8～2.0之间时，适用ddPCR检测。(1）
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9.4ddPCR检测
9.4.1对照和平行
检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以霍乱弧菌标准菌株DNA或含目的片段的DNA作为阳性对照，利用细菌基因组提取试剂盒按步骤9.2提取的大肠埃希氏菌标准菌株DNA作为阴性对照.用等体积的双蒸水代替DNA模板作为空白对照。每个待检样品提取的DNA溶液进行3个平行ddPCR检测。
9.4.2反应体系
按照表1配制反应体系
表1ddPCR反应体系
试剂名称
数字PCR反应预混液
gbpA-F
gbpA-R
gbpA-p
tcpA-F
tcpA-R
tcpA-P
DNA模板
体系总体积
微滴生成
储备液浓度
10μmol/L
10 μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
终浓度
0.75μmol/l
0.75μmol/L
0.25mol/L
0.75μmol/L
0.75μmol/L
0.25μmol/L
将配制好的数字PCF反应混合液，加入微滴生成装置加样孔中，按仪器操作说明生成微滴。9.4.4ddPCR扩增
将生成的微滴缓慢转移至96孔板中，封萨后置于PCR仪上，按以下参数进行PCR扩增：95℃10min（升降温速度：1℃/s）；94℃30s（升降温速度C/s），60℃1min升降温速度：1℃/s），45个循环；98℃10min（升降温速度：1℃/s）)，4℃保存反应产服务
注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整9.4.5荧光信号读取
扩增反应结束后，将96孔板放人ddPCR检测仪中对每个微滴进行荧光检测采用FAM和VIC通台
道分别读取gbpA基因及tcpA基因扩增的荧光信号。10
结果分析与表述
阐值的设定
根据空白对照的终点荧光值设定值限，阈值限应对空白和阳性扩增结果进行明确的区分。4
10.2质量控制
10.2.1体系分隔产生的有效微滴的总数量满足所用ddPCR仪器型号要求10.2.2阴性对照和空白对照无荧光信号检出。10.2.3阳性对照有荧光信号检出且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开。SN/T5364.2—2021
10.2.4以上质控条件有一项不符合者，实验结果视为无效，查找原因后再次进行ddPCR检测。10.3结果表述Www.bzxZ.net
10.3.1待检样品所有微滴gbpA基因及tcpA基因对应的荧光信号均低于阈值限，待测样品中不含有霍乱弧菌，检测结果表述为“未检出霍乱弧菌”。10.3.2待检样品3个平行中至少1个平行gbpA基因有荧光信号高于阈值限的阳性微滴，且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开，该样品结果为霍乱弧菌初筛阳性，对样品的增菌液进一步按SN/T1022中的操作步骤进行确认后报告结果。术为
10.3.3满足8.3.2的情况下，若tcpA基因同时出现荧光信号高于阈值限的阳性微滴，则该样品结果为含有毒力基因的霍乱弧菌初筛阳性，对样品的增菌液进一步按SN/T1022中的操作步骤进行确认后报告结果。
11防污染措施
中附录D的规定执行
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附录A
(资料性）
霍乱弧菌特异性基因序列片段
A.1霍乱弧菌gbpA基因序列（部分）及引物设计示意图（AccessionNo.EUo72441.1)见图A.1。3ol tgggtaaagc gcccaattca agctggccca caaaccttcy agtggacgtt caccgccaac3ol cacglcacaa aggallggaa alaclacall accaaaccaa aclggaaccc aaaccagecaftot.cccctc atccatt.tsa cctcaatacq t.totgtgt.cg ttgaaggaaa tatggtgcag221
t8l ccaccaaaac gtgtcagcca cgaatgtatc gtgcetgagc gcgaagggta tcaggtcate图A.1霍乱弧菌gbpA基因序列（部分）及引物设计示意图注：阴影部分分别为gbpA上下游引物序列，方框部分为探针序列。A.2霍乱弧菌tcpA基因序列（部分）及引物设计示意图（AccessionNo.KP187623.1)见图A.2。421 aCCCagCac =L9Lagac LLL99LL=c =gCLag99O LEL9lLLCc =LLLELCC481gtaaaaqaag qtgatttaga tgatqtagt gatettigg-g a.z.cgaaae gag-gacgcao4l gatgctgcta ctggcgctgg cgtaattaag tecattgcac caggaagtgc caacttaaac6cl claaclaala Lcacgcalgl Lgagaagcll Lglacaggaa clgclccall cacaglagcu图A.2看
霍乱弧菌tcpA基因序列（部分）及引物设计示意图行业标准信息服务平台
注：阴影部分分别为tcpA上下游引物序列，方框部分为探针序列。SN/T 5364.2-202
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第2部分：霍乱弧菌
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中国标准出版社秦皇岛印刷广印刷*
开本880×12301/16印张0.75字数22千字2022年6月第一版2022年6月第一次印刷印数1—500
书号：155175：732
定价12.00元
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