SN/T 5364.3—2021
基本信息
标准号： SN/T 5364.3—2021
中文名称：出口食品中致病菌检测方法微滴式数字PCR法第3部分:溶藻弧菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
相关标签： 出口 食品 致病菌 检测 方法 数字 PCR 弧菌
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 5364.3—2021.
1范围
SN/T 5364.3规定了食品中溶藻弧菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于食品中溶藻弧菌的快速定性检测。
SN/T 5364.3的检出限为1CFU/25 g~5 CFU/25 g(或1CFU/25 mL~5 CFU/25 mL)。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
NMKL No.156食品致病性弧菌的检测和计数(Pathogenic Vibrio species detection and enumer-ation in foods)
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA( deoxyribonuleic acid):脱氧核糖核酸。
ddPCR(droplet digital polymerase chain reaction):微滴式数字PCR。PCR(poly merase chain reaction):聚合酶链式反应。
5方法原理
针对溶藻弧菌GroEL基因保守序列设计引物、探针,将一定浓度的引物、探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合﹐配成 PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到10 000~20 000个微滴中﹐使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或o,然后进行PCR扩增。GroEL基因探针5’端标记FAM
1范围
SN/T 5364.3规定了食品中溶藻弧菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于食品中溶藻弧菌的快速定性检测。
SN/T 5364.3的检出限为1CFU/25 g~5 CFU/25 g(或1CFU/25 mL~5 CFU/25 mL)。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
NMKL No.156食品致病性弧菌的检测和计数(Pathogenic Vibrio species detection and enumer-ation in foods)
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA( deoxyribonuleic acid):脱氧核糖核酸。
ddPCR(droplet digital polymerase chain reaction):微滴式数字PCR。PCR(poly merase chain reaction):聚合酶链式反应。
5方法原理
针对溶藻弧菌GroEL基因保守序列设计引物、探针,将一定浓度的引物、探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合﹐配成 PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到10 000~20 000个微滴中﹐使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或o,然后进行PCR扩增。GroEL基因探针5’端标记FAM
标准图片预览
标准内容
ICS07.100.30
CCSX04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5364.3—2021
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第3部分：溶藻弧菌
业标准信息服务平台
Droplet digital PCR method for detection of pathogens in exportfood-Part 3Vibrio alginolyticus
2021-11-22发布
2022-06-01实施
中华人民共和国海关总署
SN/T5364.3-2021
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
SN/T5364一2021《出口食品中致病菌检测方法微滴式数字PCR法》共分为8个部分第1部分：副溶血性弧菌；
第2部分：霍乱弧菌；
第3部分：溶藻弧菌；
第4部分：创伤弧菌；
第5部分：金黄色葡萄球菌；
第6部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第7部分：产志贺毒素大肠埃希氏菌；第8部分：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）。本文件为SN/T5364一2021的第3部分。为准
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津海关。
本文件主要起草人：李丹、徐蕾蕊、魏海燕、魏咏新、马丹、付薄博、赵晓娟、曾静、董志珍、高飞。1
1范围
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第3部分：溶藻弧菌
本文件规定了食品中溶藻弧菌的微滴式数字PCR检测方法本文件适用于食品中溶藻弧菌的快速定性检测。SN/T5364.3—2021
本文件的检出限为1CFU/25g～5CFU/25g（或1CFU/25mL~5CFU/25mL）。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测食品致病性弧菌的检测和计数（PathogenicVibriospeciesdetectionandenumerNMKLNo.1561
F式出
ation infoods)
术语和定义
本文件没有需要男定的术语和定义。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
服务平
PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应。方法原理
针对溶藻弧菌GroEL基因保守序列设计引物、探针.将一定浓度的引物、探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到1000020000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或O，然后进行PCR扩增。GroEL基因探针5\端标记FAM荧光基团，利用数字PCR系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴族。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有溶藻弧菌。
SN/T5364.3—2021
6主要设备及耗材
6.1天平：感量0.1g。
6.2均质器。
6.3恒温培养箱：36℃±1℃。
6.4高速台式冷冻离心机（离心力12000g）。6.5涡旋振荡仪。
6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7生物安全柜。
6.8ddPCR扩增仪及相关配套设备。6.9不同量程移液器：1001000u、20μ~20010μ100u0.5u~106.10
离心管：2mL.1.5mL和0.2mL。
材料与试剂
文本为准
7.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。7.2细菌基因组提取试剂盒。
7.3ddPCR反应配套试剂。
7.4去游离核酸酶：伯乐！）
7.5阳性对照：溶藻弧菌标准菌株DNA，或含目的片段的DNA亦可。7.6溶藻弧菌GroEL基因特异性序列片段参见附录A，引物探针如下：VA-F:52-GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGACAC-3';VA-R.5'-ACCCACACGCTCCATTGC3
VA-P:FAM-TCTCTGCAAACTCAGACGCAAGCGTAGG-BHQ1-3'8检测程序
标准信息服务平台
食品中溶藻弧菌ddPCR检测程广见图11）给出这一信息是为了方便本文件使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。
衍测群品
参照NMK[.Nb.]落迹行样品制备和增案细南LNA提取
ddPCRE城
结果观察
传统存法硝认
正式出片
食品中溶藻弧菌ddPCR检测程序
实验操作步骤
样品制备
参照NMKLNo1sS中的方法进行样品制备和增菌。9.2DNA提取
SN/T5364.3—2021
直接取9.1获得的增菌液2ml加到无菌离心管中，8000g离心2min，尽量吸弃上清；利用100uL磷酸盐缓冲液重悬沉淀，加入20u去游离核酸酶，置于37℃作用15min～30min，95℃加热10min使酶失活。继而利用细菌基因组提取试剂盒提取IDNA，操作方法按试剂盒说明书进行。9.3DNA浓度和纯度测定
取适量DNA原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分折仪或紧外分光光度计测定260nm和280nm处的吸收值，按照式（1)计算DNA的浓度。P=A20×NX50
式中：
DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；260nm处的吸光值；
—核酸稀释倍数
当DNA浓度为0.1ug/mL~100ug/mL，A/A2在1.8~2.0之间时，适用ddPCR检测。3
SN/T 5364.3—2021
9.4ddPCR检测
9.4.1对照和平行
检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以溶藻弧菌标准菌株DNA或含目的片段的DNA作为阳性对照，利用细菌基因组提取试剂盒按步骤9.2提取的大肠埃希氏菌标准菌株DNA作为阴性对照，用等体积的双蒸水代替DNA模板作为空白对照。每个待检样品提取的DNA溶液进行3个平行ddPCR检测。
9.4.2反应体系
按照表1配置反应体系。
表1ddPCR反应体系
试剂名称
数字PCR反应预混液
DNA模板
体系总体积
微滴生成
储备液浓度
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
式出版
终浓度
0.75mol/L
0.75μmol/L
D.25μmol/L
10 μL
20 μL
将配制好的数字PCR反应混合液，加人微滴生成装置加样孔中，按仪器操作说明生成微滴。9.4.4ddPCR扩增
将生成的微滴缓慢转移至96孔中封膜后置于PCR仪上，按以下参数进行PCR扩增：95℃10min（升降温速度：1℃/s）；94℃30s（升降温速度：1℃/s），58℃1min（升降温速度：1℃/s），45个循环98℃10min（升降温速度：1℃/s），4℃保存反应产物。注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。9.4.5荧光信号读取
扩增反应结束后，将96孔板放人ddPCR检测仪中对每个微满进行荧检测，采用FAM通道读取荧光信号。
结果分析与表述
10.1阅值的设定下载标准就来标准下载网
根据空白对照的终点荧光值设定阅值限，阈值限应对空白和阳性扩增结果进行明确的区分。4
10.2质量控制
10.2.1体系分隔产生的有效微滴的总数量满足所用ddPCR仪器型号要求10.2.2阴性对照和空白对照无荧光信号检出。10.2.3阳性对照有荧光信号检出且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开。SN/T5364.3—2021
10.2.4以上质控条件有一项不符合者，实验结果视为无效，查找原因后再次进行ddPCR检测。10.3结果表述
10.3.1待检样品所有微滴的荧光信号均低于阅值限，待测样品中不含有溶藻弧菌，检测结果表述为“未检出溶藻弧菌”。
10.3.2待检样品3个平行中至少1个平行有荧光信号高于阅值限的阳性微滴，且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开，该样品结果为溶藻弧菌初筛阳性，对样品的增菌液进一步按NMKLNo.156中的操作步骤进行确认后报告结果。为准
11防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。5
SN/T5364.3—2021
附录A
(资料性）
溶藻弧菌特异性基因序列片段
溶藻弧菌GroEL基因序列（部分）及引物设计示意图（AccessionNo.KX094897)见图A.1。1aa9a1aaaa0ga09aag9a0aa
121Leleeaaasl cagaaeeaagoelagataacalcallgclgaagcaalggagcglglgggl图A.1溶藻弧菌GroEL基因序列（部分）及引物设计示意图注：阴影部分分别为上下游引物序列，方框部分为探针序列。SN/T 5364.3-2021
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第3部分：溶藻弧菌
SN/T5364.32021
京市朝阳区东四环南路甲1号（100023）编楞音：010）05194242-7509
网址custonskb.com/book
中国标准出版社秦皇岛印赢厂印刷开本880X12301/16印张0.75字数22千字2022年6月第一版2022年6月第一次印刷印数1—500
书号：155175：733
定价12.00元
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
CCSX04
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5364.3—2021
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第3部分：溶藻弧菌
业标准信息服务平台
Droplet digital PCR method for detection of pathogens in exportfood-Part 3Vibrio alginolyticus
2021-11-22发布
2022-06-01实施
中华人民共和国海关总署
SN/T5364.3-2021
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
SN/T5364一2021《出口食品中致病菌检测方法微滴式数字PCR法》共分为8个部分第1部分：副溶血性弧菌；
第2部分：霍乱弧菌；
第3部分：溶藻弧菌；
第4部分：创伤弧菌；
第5部分：金黄色葡萄球菌；
第6部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第7部分：产志贺毒素大肠埃希氏菌；第8部分：克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）。本文件为SN/T5364一2021的第3部分。为准
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中国海关科学技术研究中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津海关。
本文件主要起草人：李丹、徐蕾蕊、魏海燕、魏咏新、马丹、付薄博、赵晓娟、曾静、董志珍、高飞。1
1范围
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第3部分：溶藻弧菌
本文件规定了食品中溶藻弧菌的微滴式数字PCR检测方法本文件适用于食品中溶藻弧菌的快速定性检测。SN/T5364.3—2021
本文件的检出限为1CFU/25g～5CFU/25g（或1CFU/25mL~5CFU/25mL）。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测食品致病性弧菌的检测和计数（PathogenicVibriospeciesdetectionandenumerNMKLNo.1561
F式出
ation infoods)
术语和定义
本文件没有需要男定的术语和定义。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
服务平
PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应。方法原理
针对溶藻弧菌GroEL基因保守序列设计引物、探针.将一定浓度的引物、探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到1000020000个微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或O，然后进行PCR扩增。GroEL基因探针5\端标记FAM荧光基团，利用数字PCR系统的检测通道，可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴族。最终根据阳性微滴的有无判定样品中是否含有溶藻弧菌。
SN/T5364.3—2021
6主要设备及耗材
6.1天平：感量0.1g。
6.2均质器。
6.3恒温培养箱：36℃±1℃。
6.4高速台式冷冻离心机（离心力12000g）。6.5涡旋振荡仪。
6.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.7生物安全柜。
6.8ddPCR扩增仪及相关配套设备。6.9不同量程移液器：1001000u、20μ~20010μ100u0.5u~106.10
离心管：2mL.1.5mL和0.2mL。
材料与试剂
文本为准
7.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。7.2细菌基因组提取试剂盒。
7.3ddPCR反应配套试剂。
7.4去游离核酸酶：伯乐！）
7.5阳性对照：溶藻弧菌标准菌株DNA，或含目的片段的DNA亦可。7.6溶藻弧菌GroEL基因特异性序列片段参见附录A，引物探针如下：VA-F:52-GAGCTTTCTGTTGAATGTAACGACAC-3';VA-R.5'-ACCCACACGCTCCATTGC3
VA-P:FAM-TCTCTGCAAACTCAGACGCAAGCGTAGG-BHQ1-3'8检测程序
标准信息服务平台
食品中溶藻弧菌ddPCR检测程广见图11）给出这一信息是为了方便本文件使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。
衍测群品
参照NMK[.Nb.]落迹行样品制备和增案细南LNA提取
ddPCRE城
结果观察
传统存法硝认
正式出片
食品中溶藻弧菌ddPCR检测程序
实验操作步骤
样品制备
参照NMKLNo1sS中的方法进行样品制备和增菌。9.2DNA提取
SN/T5364.3—2021
直接取9.1获得的增菌液2ml加到无菌离心管中，8000g离心2min，尽量吸弃上清；利用100uL磷酸盐缓冲液重悬沉淀，加入20u去游离核酸酶，置于37℃作用15min～30min，95℃加热10min使酶失活。继而利用细菌基因组提取试剂盒提取IDNA，操作方法按试剂盒说明书进行。9.3DNA浓度和纯度测定
取适量DNA原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分折仪或紧外分光光度计测定260nm和280nm处的吸收值，按照式（1)计算DNA的浓度。P=A20×NX50
式中：
DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；260nm处的吸光值；
—核酸稀释倍数
当DNA浓度为0.1ug/mL~100ug/mL，A/A2在1.8~2.0之间时，适用ddPCR检测。3
SN/T 5364.3—2021
9.4ddPCR检测
9.4.1对照和平行
检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以溶藻弧菌标准菌株DNA或含目的片段的DNA作为阳性对照，利用细菌基因组提取试剂盒按步骤9.2提取的大肠埃希氏菌标准菌株DNA作为阴性对照，用等体积的双蒸水代替DNA模板作为空白对照。每个待检样品提取的DNA溶液进行3个平行ddPCR检测。
9.4.2反应体系
按照表1配置反应体系。
表1ddPCR反应体系
试剂名称
数字PCR反应预混液
DNA模板
体系总体积
微滴生成
储备液浓度
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
式出版
终浓度
0.75mol/L
0.75μmol/L
D.25μmol/L
10 μL
20 μL
将配制好的数字PCR反应混合液，加人微滴生成装置加样孔中，按仪器操作说明生成微滴。9.4.4ddPCR扩增
将生成的微滴缓慢转移至96孔中封膜后置于PCR仪上，按以下参数进行PCR扩增：95℃10min（升降温速度：1℃/s）；94℃30s（升降温速度：1℃/s），58℃1min（升降温速度：1℃/s），45个循环98℃10min（升降温速度：1℃/s），4℃保存反应产物。注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。9.4.5荧光信号读取
扩增反应结束后，将96孔板放人ddPCR检测仪中对每个微满进行荧检测，采用FAM通道读取荧光信号。
结果分析与表述
10.1阅值的设定下载标准就来标准下载网
根据空白对照的终点荧光值设定阅值限，阈值限应对空白和阳性扩增结果进行明确的区分。4
10.2质量控制
10.2.1体系分隔产生的有效微滴的总数量满足所用ddPCR仪器型号要求10.2.2阴性对照和空白对照无荧光信号检出。10.2.3阳性对照有荧光信号检出且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开。SN/T5364.3—2021
10.2.4以上质控条件有一项不符合者，实验结果视为无效，查找原因后再次进行ddPCR检测。10.3结果表述
10.3.1待检样品所有微滴的荧光信号均低于阅值限，待测样品中不含有溶藻弧菌，检测结果表述为“未检出溶藻弧菌”。
10.3.2待检样品3个平行中至少1个平行有荧光信号高于阅值限的阳性微滴，且阴性微滴簇与阳性微滴簇能够截然分开，该样品结果为溶藻弧菌初筛阳性，对样品的增菌液进一步按NMKLNo.156中的操作步骤进行确认后报告结果。为准
11防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附录D的规定执行。5
SN/T5364.3—2021
附录A
(资料性）
溶藻弧菌特异性基因序列片段
溶藻弧菌GroEL基因序列（部分）及引物设计示意图（AccessionNo.KX094897)见图A.1。1aa9a1aaaa0ga09aag9a0aa
121Leleeaaasl cagaaeeaagoelagataacalcallgclgaagcaalggagcglglgggl图A.1溶藻弧菌GroEL基因序列（部分）及引物设计示意图注：阴影部分分别为上下游引物序列，方框部分为探针序列。SN/T 5364.3-2021
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口食品中致病菌检测方法
微滴式数字PCR法
第3部分：溶藻弧菌
SN/T5364.32021
京市朝阳区东四环南路甲1号（100023）编楞音：010）05194242-7509
网址custonskb.com/book
中国标准出版社秦皇岛印赢厂印刷开本880X12301/16印张0.75字数22千字2022年6月第一版2022年6月第一次印刷印数1—500
书号：155175：733
定价12.00元
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。