本标准规定了饲料中转基因成分的定性检测方法。 SN/T 1201-2003 植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法 SN/T1201-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net
本标准规定了饲料中转基因成分的定性检测方法。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 12012003
植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法
Protocol of PCR for detection of genetically modified feed州市
心码行
2003-03-17发布
中华人民洪和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-09-01实施
本标推由国家认证认可监督管委员会提出并归口，SN/T12012003
本标准由中华人民共和国深圳出人境检验检按局负贵起草，中国进口商品检验技术研究所参加起草。
本标准主要起草人，章桂明、王、余道坚、康林，杨伟东，金显忠、稀颖慧、陈技楠、徐宝梁、本标准系首次发布的检验检疫行业标准。1范图
植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法
本标准规定了间料中转基因成分的定性测方法。SN/T1201—20D3
本标准中定性检测方法适用于以转基因大RoundupReady，转基因玉水（BTl1,BT176、MON810，T14/25，CBH351)和转基因油荣材（抗草I脾除毕剂、抗草丁脾除草剂、排性不育）为原料所如工的饲料中转基因成分的定性检测,2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条效。凡是注明日期的引用文件.其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）攻修改版均不适合于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标推。SN/T0798进出口粮袖料检验检验名术语SN/T1193基围分析检测实验室技术要水SN/T1194植物及其产品中转基因成分检测批样和制样方沃女米中转基因成分定性CR检测方法SN/T 1196
SN/T 1197
油菜籽中转基因成分定性[CR检测方法SN/T1204植物及其加工产晶中转基因成分实时旋光PC:R定性检验方法3术语,定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本标剂。3.1
转基因饲料geneticallymodifledfeed（GMF）过过基国重组技术获得的基因改良牛物加工而成的彻料。3.2
合酶链式反应polymerasechalnreaclion（PCR）模板DNA先经高温变性为单链，在适宜的盘度下和级冲落液中，两条引物分别与模板INA两条链上的一段互补序列发生退火，接格在L>NA娠合酶的做化下以四种dNTF为底物，使退火引物得以她神，如此反复变性、退火和DNA合成循环，他位于两段引物序列之间的I)NA片段早儿何倍数扩增。3.3
定性检测 qualhatlve detectlon对样品中转基因成分进行检测，以判定该样品是作为转其因产品。3.4
缩略语
3.4. 1GMorgeneically modifed organism,转基因牛物。.3.4.2CaMy35S.35S promoter from tauliflawer ntosnn:virus花娜来花病毒 35S启动子。SN/T 1201--2D03
3. 4. 3 NOS,termin&tor of nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens,来源于农杆的因脂碱合成酶基因终止子,
3. 4. 4 CP4 EPSPS:5-enolpyruvylahlkimate-3-phoephate 9ynthase gene,5-葬草酸-3-碘合成酶基因.3.4.5RRS,RoundupReadyTMSoybean，要国Monento公司转基因抗除草剂大臣。3. 4. 6IVR,Invertase 1 gene from maize+玉米转化酶 1 基因.3. 4,7Npt Ⅱ , neomycin-3'-phosphotransferase gene,新章素-3'-磷酸转移酶基因,3. 4, 8 CrylA(b), a synthetile gene encoded the firat 64B amino acids, insecticidal-nctive truncatedproduct identicel to that of cryIA(b) gene af Bacillus thuringiensir subsp, Kurstaki steain HD-l 苏云金芽孢杆菌结晶强蛋白(Cry)I型毒素抗虫基因。4源理
转基因饲料定性检测是利用外源基因与植物本身基因的不间,通过设计只能扩增外源基因中 DNA片段的引物种进行 PCR扩增，根据实验结果,判定该饲料是否带有外源基因成分，5试剂
5. 1 SDS 提取疫:1. 5%SDS,EDTA-Na, 100 mmol/L(pH 8. 0), Trig-HCI 20 mmol/L(pH 8, 0),氧化钠5.2“Trla 饱和盼，
5. 3三氯甲烷。
5.4异戊醇。
5.5异丙醇。
5, 670%乙醇。
RNA 酶(10 mg/mL).
琼脂糖。
三羟甲基数基甲烷(Tris),
冰乙酸。
EDTA(PH8. 0).
10×PCR爆冲液，
Tq DNA 巯合酶.
5. 15澳化乙(1D mg/mL).
5. 16 100 bp ladder DNA Marker。5. 17
液摄，
5. 18TAE(50X)缓冲滤,
10×加样规冲液,0.25%澳酚蓝,40%蔗糖。6 仪谢设备
6. 1 研。
6.2水浴锅.
6.3电子天平(精度：1/1 000 以上)。6.4普通高心机。
6. 5低温冷冻高速高心机。
.6.6冰箱.
6,7低没冰箱（一40℃)。
6.8榭冰机。
6.9伍温干燥箱。
6. 10 pH计:
移液器t0, 1 μL.,D, 5 μL,2 ±L,10 μi.,20 μL,100 μl.,200 μL,1 000 μ..2紫外可见分光光度计。
纯水机.
高下消酶锅。
PCR管.0, 2 mL.0.5 ml
离心管,1, 5 ml.,2. 0 ml..
Tip 头:0, 1 μL~- 10 μL,5 μL~200 μI.,100 μi,--500 μL.6. 17
PUR仪。
电泳仪。
凝腔分析战像系统。
防亏辣措施
SN/T 1201--2003
植物性间料转基因成分定性PCR检测方法中所婴求的实验室防污染措施按照SN/T1193规定的方法执行。
8抽样与衡样
植物性饲料转基因成分定性PCR检测方法中样品的抽样和制样按版SN/T1194规定的方法执行。
9 DNA 提取及浓查测定
9, 1 DNA 提取
9. 1. 1 f
改离 SIS 方法
称取样品 5 B-在研缺中加人获氨研磨至样品坐 0. 5 mm 左右的粉末,）
b）称取300mk腰碎的样品，迅速转人2mI.离心筛中，划1.5mI.65℃ SDS提取缓冲液混匀，放入65℃水浴锅中水浴15 mn.
15000g离心15min，取上清液lml.e)
加 RNase(终度 10 μg/mL).37C水浴 30 nin。d)
加人等体积Tria炮和酚，充分勾，e
13000g离心15min，取上清液800叫人400μlTris饱和酚及400L兰氯甲烷-异戏醇(V : V=24 + 1)混勾-
15 000g离心10 min,取上清液 600 μL,加人 60U μL,三氯甲烷-异戊醇(V/V24 1)混句,l)15 000g离心 5 min,取上清渡 300 μl,加人 600 μl.异丙醇,轻轻混匀,冰浴 10 min。13 000 g再心 5 m1n 取况淀,并用 1 ml. 70%乙醇清洗三饮。倒去乙醇,离心,用吸管尽可能吸驳去剩余乙醇。干燥后加人 100 μL 去离子水游解 DNA,k) 低温(一20 )保存。
9.1.2试剂盒法
不同基因组 DNA 提取试剂盒使用时按操作说明书操作。9. 2DNA 浓度谢定
样品DNA用紫外分光光度计测定260nm和28011m处吸收值，分别计算核酸的纯度和浓度，计算3
SN/T 1201—2003
公式见式(1)、式（2)，
DNA纯度 =OD/OD
DNA 浓度(rg/mL) =50 × OD
PCR 级 DNA 溶的 ODapn/ODmpm比值为 1. 7~1, 9。10 定性 PCR 检测方法
定性 PCR 检撕括对侧料三种主要成分;大豆、玉米和袖莱内源基因和外源基困的检测。先通过内谦基因的检测，确定该炳料是否含有相应成分，烯后再检测CaMV35S和NOS等外阅基因，确定上违主再成分是否含有外试基因r最后通过外谢些定基因确定转基因的品种。每次 PCR检测须设立相应的阳性对照,非 GMO 阴性对照和水空白对照.10. 1定性 PCR检测方法
10. 1. 1食大豆转基固成分的饲料定性 PCR 检测先检测大豆内源Lectin基因，然后检测CaMV35S启动子，NOS终止子外激基因1最后检测抗除草剂基因 CeMV35S/CP4-EPSPS 的外源基因。10. 1. 1. 1 PCR 所用引特
PCR扩增所用的引物的序及扩增片段长度见衰1衰 1定性 PCR 检测危大豆转基因戏分的焖料内、外调基固的引物序死世检德基因
Leclin
CaMy 35s
CP4-EPSPS
基因性质
大互内源基因
外镇基因
外潮基因
PCR 扩增反应体系
10. 1. 1.2
PCR 扩增反应体事表 2 .
引物序列
5'-GACGCTATTGTGACCTCCTC-3\
5'-TGTCAGGGGCATAGAAGGTG-3
S-GCTCCTACAAATGCCATC-9
5'-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3
5'-TTAAGATTGAATCCTGTTGCCG-3
5'-TAATITATCCTAGTTTGCGCGC-3\5'-CCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCC-3S'-CTTCTGTGCTGTAGCCACTGATGC-3表 2定性 PCR检测植物性衡料内,外课基因的反应体系试剂名称
10 × PCR 域冲准
戴化恢(MgCls）
Taq 牌
正义引物
反义引物
DNA横板
双荔水
延备按抑度
25 mmbl/L
2. 5 mmol/ L.
10 prmol/μL.
5dng~200ng
25 μL 反应体系
神量/L
扩增长度
50μL反应体
10. 1. 1. 3PCR 扩增程序
PCR扩增程序见表 3.
SN/T 1201-2003
表 3 定性 PCR 检测含大互转基因成分的饲料内、外源基因的反皮扩增程序被扩增的基因
[ectin
CI4 EPSPS
CaMV35S
预变性
10. 1. 1. 4 PCR 产物凝胶电泳扩罐
94℃20、
55℃,4 s
72,1thm
循环欧教
量终延伸
721.5 tnin
将配制好的 1. 5%的琼脂糖凝胶效人 1 × 7AE也极缓冲波的电泳槽中,用移液器取 2 μ1. 1 ×加样缓净液在下净的封口膜上，再分别移取上述扩增产物10μL,加人21×电泳上样缓冲液，与其混匀，上样到1.5%的琼脂糖凝胶t.,并点上Marker。恒压5V/etn恒压，30min，再置于避胶成像系统中观赛，打印并保存实验结果。
10. 1. 2 含玉米转基因成分间料的定性 PCR 检先检测,下米内源 IVR 基因,然后检测 CaMV 35S,NUS 或 NPT 口 等外源基因,最后检测 CRYIA(b)以及 SN/T 1196 上列出的 1VS/PAT,Mnize genome/LaMV35S,HSP70/CrylA(b),CDPK/Cry1A(h)CaMV35S/PA,CaMV35S/PAT和Cry5C/Ster外谢鉴定基因以进行转基因品种鉴定，含玉来转基因成分的例料内源基因和外源基因PLI检测所用的引物、及应体系和扩增和序见表4,表 2 和表 5,其外源鉴定基叫的定作 PL'R 检测按 SN/T 1196 进行. PCR 产物凝胶电泳方法同10.1.1.4.
衰 4 定性 PCR 检测含玉来转基因成分的饲料内、外源基因的引物序列检测基因
CeMV 355
CRYIATb)
基因性质
玉米内源基固
外源基因
外基因
外源基因
外源基因
引物序列免费标准bzxz.net
5'-CCGCIKTATCACAATGGCTCUTACC-35'-GAGCCGTGTAGAGCATGACGATC-3EIGCTLLTAGAAAGCCATCA-3'
5'-GATAG TGGGATIGTCGTGA 3'
5-TTAAGATTGAATCCTGTTGCCG-3
G'-TAATTEATCCTAGITTGCGCGC-3
5'-CICACCTTGCTCCIGXAGA-3
5'-CGCCTTGAGCCTGXIAACAG-3
SCTGTGGACAICATCTGGGCCATCTTCC-35'-TIGGTACAGGTIGCITAGGCCCICC 3'定性 PCR 检测含玉米转基因成分的饲料内,外源基固的扩增程序表5
被扩增的基因
CRYIA(b)
CAMY 35S
预变竹
95c5mn
95℃.,30-
41t,20 -
72t,1un
循环次
扩增长度/p
最线延伸
72℃,5 Rn
SN/T 1201—2003
10. 1. 3禽油药转基因成分细料的态性 FCR 检测先检测油菜内激 PE3-PEPCese 基因,热后检谢 CaMV 35S,FMV 35S,NOS 或 NPT 口 等外源基因,最后检测外激鉴定基因 BAR(PAT),BARNASEBARSTAR,CP4-EPSPS(修怖)和 GOX(修怖)等含转基因油巢底分的情料外源基因 PCR 检测所用的了I物,反应体系和扩增序见表 4,表 2 和表5,其内旗基因和外摄整定基因的定性PCR检测按 SN/T 1197进行。10. 1. 4 合转基因温合效分烟料的定性 PCH检测含有两种取两种以上转基因的植物产品主要股分的凋合间料，要分别对各主要成分的内,外操基因进行 PCR 定性检测,其检谢方祛同 10. 1, 1,10. 1, 2 和 10, 1. 3,10,2 定性 PCR 破酸证实验
定性 PCR 验证实验按 SN/T 1197 进行。11结果判定与表述
11, 1蝴果判宠
11. 1, 1内题著困的换获
用针对待测样品的内源基因的引物对所抽体的 DNA 进行 PCR 检谢,阴性对脏,阳性对朋和特测样品均盘被扩增出已经片段长度的 PCR产物。如未见有该 PCR扩增，则说明 DNA提取质量有问题，或 DNA 摄取浓中有抑制 PCR 产物的因于存在,应章新提取 DNA,直到扩增出该 PCR 产物。11. 1. 2外娠基因的检测
对持测样品 DNA 提取波进行外调基因的 PCR 检测,如果阴性对照和空白对照未出现条带,阳性对服和特测样品均出现预期大小的扩增条带，则可初步判断特测样品中含有外激基因,进一步验证实验按 SN/T 1204进行。
11. 2歧果衰
检出基因，
末检出××X基因，
12 样品和原始数播保存
12. 1样品保存
存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保存其个月。如发现转基因,该样品保存一年,以备复验、嵌帮和仲赖，保存期满后,需经处理,12, 2腰始数据保存
转基因样品检测绪束启，其原始记录单和检验报告或证书应归档,妥替保管，以备复验、谈判和伸赖·
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