本标准规定了马铃薯中的转基因成分的定性PCR检测方法。 SN/T 1198-2003 马铃薯中转基因成分定性PCR检测方法 SN/T1198-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net
本标准规定了马铃薯中的转基因成分的定性PCR检测方法。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1198—2003
马铃薯中转基因成分定性PCR检测方法Protocol of the polymerase chain reaction for detectinggenetically modified components in potatoes2003-03-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-09-01实施
本标准的附录A为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主耍起草人高宏希、梁成珠、张艺兵、权活霞。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T 1198-2003
1范图
马铃中转基因成分定性PCR检测方法本标准规定了马铃要中的转基因成分的定性 PCR检测方法。SN/T1198—2003
本标准适用于转基因马铃薯品种（NEWLEAF）POTATOLINESBT-06，ATBT04-06ATBT04-3I,ATBT 04-36 AND SPBT 02-05;(NEW LEAF PLUS) POTATO LINESPBMT21-129,PBMT21-350ANDPEMT22-82,(NEWLEAFY)POTATOLINESRBMT15-101,SEMT15-02ANDSEMT15-15等品种的转基因马铃薯块茎、植株、生警条，生薯片、淀粉的检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的静改单（不包括勘误的内容）或订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不往日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T1194植物及其产品转基因成分检翘抽样和制样方法SN/T1204植物及其加工产品转基因成分实时荧光PCR定性检验方法3术语、定义和缩略语
下列术语和定义(缩路语)适用于本标准。3.1
转基用transgene
将物种本身不具有的,来源于其他物种的功能 DNA 序列,通过各种导入手段,使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品种特征。3.2
聚合酶链式反应polymerase chain reaction,PCR模板基因序列先经高温变性成为单链,在 DNA 素合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合,接着在 DNA 案合醇的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。3.3缩略语
3. 3. 1 Pata;马铃薯种属特异性 DNA 引物,扩增的片段为马铃幕块茎些藏蛋白 Patatin 基因片段。3.3.2CaMV 35S:promater from cauliflomer mnosaic virus,花棒菜花叶病毒35S启动子。3. 3.3NPT-IⅡI ; neomycin phasphotransferase-II ,新霉素-3*-磷酸转移酶,3. 3, 4NOS:nopaline synthase terminator,胭脂碱合成酶 3'转录终止子。3.3.5PVYcpipotato Y virus coat protein,马铃薯Y病毒外尧蛋白，3.3.6 cty 3A:一个由 B.thuringiensis subsp,Tenebrionis (B, t, t, ） strain Bl 256-82的蛋白。这个蛋白具有抗虫活性，尤其悬可以选择性的杀死科罗拉多马铃薯甲虫（Colorado potato beetle larvae)。SN/T 1198--2003
CP4 EPSPS: 5-enolpyrulshikimate-3-phosphate synthase 5-enolpyrul shikimate-3-phosphate3.3.7
synthase,来源于农杆菌 Agrobacterium sp. Strain CP4 的 5-葬草酸-3-磷酸合成酶。3.3. 8PLRVrep:potato leafroll virus,马铃薯卷叶病毒重复序列。 E93', the 3' non-translated region of the pea ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase small3.3.9
subunit (rbcS） E9 gene。,来源于豌豆的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶 E9 基因小亚基 3\端序列.3, 3. 1D ArabssU1A, arabidopsis thaliana ribulose-1*5-bisphosphate carboxylase (Rubisco) smallsubunit ats 1A promoter,arabidopsis thaliana 的核酮糖-l,5-二磷酸效化醇小亚基 1A 的启动子。3, 3. 11 aad:(resides outside T-DNA)在转座自大肠杆菌 Tn 7 中编码链霉素腺苷酰(基)转移酶的基因。
3. 3. 12 oriV:(resides outside T-DNA)-个源自农杆菌 Agrobacterium 的 RK2 质粒的 1, 3 kb 的复制区城。
3.3.13ori322：(residesoutsideT-DNA）一个源自pBR322质粒的1.8kb的片段，其中包含复制区域和转移结合位点bom
3. 3, 14 FMV 35S:a promotor derived from figwort masaic virus (FMV),玄参花叶病毒 35S启动子。4防污染指施
检测过程中防止交污染的措施按照SN/T1193中的规定执行。5抽样与制样
对于转基因样品通用的抽样方法,按照 SN/T 1194的规定执行。5.1马铃薯产品抽样量
5.1.1马铃薯块茎、生薯条、生薯片、植栋抽样量，按照表1中比例抽样。其中每包取样数的单位对于块茎、生薯条生薯片为个，对于植株为袜。表 1马龄菁块茎、植株、生菁条的抽样量批量/包
501~ 35 000
≥35001
马铃薯淀粉抽样量。
按表 2中比例抽样。
批量/包
51~150
151500
501~3200
3 201~35 000
35001~500000
≥500001
开包数目
马梦菁淀粉的抽样量
开包数日
每包取数目
每包取样数自/g
5. 2马转著试样制备
5.2.1马龄善块茎、生薯条、生菁片、植株的试样制备SN/T 1198—2003
对于同一批次的马铃薯块茎、生馨条、生馨片，把每个样品洗干净，在任意部位用小刀切下约1cm的样品作为试样用于提取 DNA。对于同一批次的马铃薯植株,取每个样品的一片叶片洗干净,用小刀切下2 cm的叶片作为试样用于提取 DNA,
5. 2. 2马铃薯淀粉试样的制备
把每包取样的120名淀粉充分混合，从每个120g中取100mg作为试样。6测定方法
6.1原理
样品经过提取 DNA 后,针对转基因植物所插人的外源基因的基因序列设计引物,通过 PCR 技术,特异性扩增外源基因的 DNA 片断,根据 PCR 扩增结果,判断该样品中是否含有转基因成分。6. 2 剂和材料
除另有规定外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水，6.2.1引物：按照表3中提供的引物序列合成引物，加人无离子水配成100pmol/uI.贮存，配成直接用于 PCR 反应的 20 pmol/μL 的工作液。 参见附录 A。表 3 转基因马龄响 PCR 检测用的引物亦列及 PCR 产物的大小引
FMV 35S
PLRVrep
引物序列
F 5*-tga cct ggs cer cac agt tat-3'R 5'-gt gat ttc agg agt tct tcg-3*F 5'-gct cct acs aat gcc etc a-3'R 5'-gat agt ggg att gtg cgt ca-3\F 5'-egt cch aag cct caa cua ggt c-3\R 5'-cat lag tg± gtg ggu tgt cag g-3*F 5'-gaa tec tgl igc cgg tct tg-3R 5*-tta tcc tag t gcg cge te-3*F5'-gge tct cetgtc ate t-3*
R 5'-gat cat cct gat cge c-3'F 5'-trg tcu tta aac tig acg ac-3*R 5'-ct ctt tca cgg agt Icc ag-3\F 5'-gaa tca agg cle tea cgt cc-3*Rs'-cat ccg cac tgc ctc Eta c-3*5'-nga gcc gte gct aac acc #et c-3'5'-tet ggg tgr tgg cet cat cg-3*片
内对照
筛选,整定检测
NEW LEAF?
筛选、整定检测
NEWLEAF*PLUS
NEW LEAF Y
筛选检测
NEW LEAF PLUS
NEW LEAFY
NEW LEAF?
筛选检微
NEw LEaF Plus
NeW leaF y
NEW LEAF+
整定检测
NEW LFAF PLUS
鉴定检测
NEW LEAFO Y
鉴定检测
NFW LFAF PLUS
NEW LEAF Y
NEW LEAF?
SN/T 1198—2003
6. 2. 2Tag DNA 案合酶.
6. 2. 3 dNTP:dATP.dTTP,dCTF,dGTP,dUTP.6. 2. 4 琼脂糖;电泳纯。
6.2.5澳化乙锭(EB)或其他染色剂。6. 2. 6三氯甲烷,
6. 2. 7异丙醇。
6. 2.870%乙醇
6. 2. 9 分子量 Marker; 50 hp~300 bp。6.2.10植物总DNA提取缓冲液：量取100mL1mol/LTris-Cl,50mL0.5mo1/LEDTA,称取5.0g十二烷基酸钠(STS),16. 8 48 g氟化钠,定容至1 L,分装灭菌备用。6.2.11TE缓冲液，10mmol/LTris-HCl,pH8.0;lmmol/LEDTApH8.0。6.2.1210×PCR缓冲液：100mmal/L氯化钾（KCl)，160mmol/L硫酸铵（NH，）SO.20mmol/L硫酸镁(MgSO,),200 mmol/L Tris-HCl(pH8. 8),1% Triton x-100,1 mg/mL BSA6. 2. 13 5 × TBE 羧冲液: Tris ,54 g,硼酸 27. 5 g,0. 5 mol/L EDTA (pH8. 0) 20 mL,加蒸馏水至1 000 ml..
6.2.1410×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖。6. 2. 15 RNA 酶(10 μg/mL)。6.2. 16聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。6.3仅摄
6.3.1固体粉碎机及研体。
6.3.2高速将冻离心机，台式小型离心机,Mini个人离心机。6.3.3水裕培养箱,恒温培养箱,恒温孵育箱。6. 3. 4 天平感量 0. 001 g。
6. 3. 5高压灭菌锅
6. 3. 6高温干煤箱。
纯水器、双蒸水器。
6. 3. 8 冷藻、冷冻冰箱。
6. 3. 9制冰机。
旅涡爆药航。
微波炉。
基因扩增仪。
电泳仪，
PCR超净工作台。
核酸蛋白分析仪。
微量移液器:0. 1 μL~2 μL,0, 5 μL~10 μL,2 μL~20 μL,10 μL~100 μL,20 μL~200 μL,200 μL~1 000 μL.
疑胶成像系统。
实时荧光 PCR仪。
6. 3. 19 Eppendorf 管 :1. 5 mL~5 mL.6.3.20PCR反应管，200μL,500μL两种规格。6.4检测方法
6. 4. 1样品 DNA 的提取与化
对于马铃块茎、尘条、生薯片、植株，每个试样充分混合置于研钵，加液氨冷冻并迅速研磨成粉4
SN/T 119B—2003
末。将 100 mg 研的粉末或淀粉粉末分装于 1. 5 mL 的 eppendorf 管中,加人 600 μL 预热的提取缓冲液，再加人200μL20%的PVP，混勾，65C保温20min，期间摇动数次。加人等体积的酚-三氟甲烷，轻轻颠倒混勾。10 000 1/rmin 离心 10 min。 取上清疫,加人三分之二倍体积的冰冷的异丙醇,混勾。 10 000 r/min离心 10 rrin。去掉上清范中的异丙醇,此时管底有白色沉淀。 向白色沉淀中加入 10 μL 的 RNA 醇< 10 mg/mL),37 亡保温 30 min。 加入 1 mL 乙酸钾(5 mnl/L)。 于 10 000 r/min 离心10 min. 去摔上清液,保留沉淀。用 70%乙醇洗漆沉淀三次,干燥。用 100 μL TE溶解沉淀,作为 PCR 反应的模板，4℃保存备用，
也可用相应市售 DNA提取试剂盒提取 DNA。6. 4. 2 PCR 扩增
6. 4. 2. 1 实验对照的设立
每个样品必须有二个平行实验,同时每次检测必须设立三个对照：阳性对照,为包含要检测基因片段的转基因植物材料的 DNA 或包含要检测基因片段的阳性质粒DNA：
阴性对照,非转基因马龄基因组 DNA：空白对照（不含DNA模板）。
6. 4. 2. 2PCR 反应体系
在 0. 2 mL PCR 反应管中,按表 4 所列顺序依次加人反应物,总体积为 25 μI 表4PCR反应体系组成成分
组皮成分
10×PCR缓冲液
4×dNTP(2.5mmol/1.)
引物 1(20 pmol/μL)
引物 2(20 pnol/μL)
TaqDNA 量合醇(5 U/μL)
UNG 萄(1 U/μL)
氧化镁(MgCl,)(25 mmol/L)
DNA棋械
无离子水
6. 4. 2. 3PCR 反应程序
25 μL 反应体积
o. 5 μt.
0, 2 μl
D. 5 μL~2. 0 μL(10 ng~50 ng DNA)使反应体积达到 25 μl.
检测不同外源基因,PCR扩增条件略有不同,不间外源基因的具体扩增程序见表 5。囊 5 PCR 反应条件参数
被扩增的外源基因
CaMV 35S.NOS,NPTII
FMV 35 5
PI.RVeep,Cry 3Aa
94 c.3 min
94 .3 min
94 C.3 min
94 c.3 min
94 C,3 min
PCR 扩增产物的凝胶电速检测
94 C.40 s+50 C,45 $+72'T.45 s94 C.40 =+54 C.45 =;72 C.45 s94 C,40 8+60 C,45 s;72 C,45 94 .40 s55 C,45 s+72 C,45 s
94 C.40 h±63 ℃,40 $+72 C,40 s撬环数
最延伸
72 C,7 min
?2 c,7 min
72C,7min
72c,7min
72 ℃,7 min
用微波炉加热溶解琼脂糖凝胶配制成 2.0%浓度的琼脂糖疑胶。将配制好的琼脂糖凝胶放人0, 5×TBE电泳缓冲液的电泳糖中,用移液器取 10 μL 扩增产物和 2 μL 6 × 载样缓冲液混合,点样到5
SN/T1198—2003
2.0%的琼脂糖凝胶上。用Marker作分子标记。在1V/cm~5V/cm电压下电泳40min，EB架色，然后用疑胶成像系统观察，照相、记录，6. 5 结果判断
6.5.1内环基因的检测
对于马铃薯种属特异性内源基因 Patetin片段的内参照引物 PATA扩增样品的 DNA,如果阴性对照，样品和阳性对照的PCR产物都出现214bp的条带，则表明提取的样品DNA符合PCR反应的要求,能用于外源基因检测;否则不能用于检测外源基因，应该重新提取样品DNA,直到扩出 214 bp的条带。
6. 5. 2外源基因的检测
对马铃薯样品 DNA提取液进行外源基因的 PC 测试，如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带，阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条帮（扩增片段大小见表3），可初步判定得测样品中含有可疑的该外源基因，应进一步进行确证试验，依据确证试验的结果最终报售如果待测样品中未出现PCR扩增产物，则可断定待测样品中不含有该外源基因。6. 5. 3筛选检测和监定检测的选据对马铃尊样品中转基因成分的检测，可考附录A的内容，先筛选检测CaMV35S、FMV35SNOS,NPTⅡ基因,筛选检测结果阴性则直接报告结果。若筛选检测绪果阳性，测需进一步定检测PLRVrep、PVYcp.Cry3A基因班确定是何种转基因马铃薯品系。
6.6确证试验
确证试验方法按照SN/T1204中规定的方法执行。7结果表述
7. 1 未趋出××X×基因。
7. 2检出×××X基因,(可进一步报告)该检测样品是××X×转基因马铃薯品系。6
公间名称及抹系
Monsailo公司
NEW LEAF PLUS
RBMT 21-129
Monsanto公司
NEW LEAF PLUS
RMT 21-350
Monsanto公司
NEW LEAF PLUS
RBMT 22-82
Mons&nto公司
NEW IEAF Y
RBMT 15-101
Monsanto 公司
NEW I.EaFo y
SEMT15-02
Mansanto公司
NEW LEAF Y
SEMT15-15
Monganto公司
NEW LEAFD
附录A
（斑料性附录》
常见转基因马铃美转入的外源基困的有关信息表 A. 1 常见转基因马铃馨转人的外源基因改良性状
1) 抗马铃著卷叶病
2)抗马龄薯甲
1）抗马铃薯粘叶病
2）抗马铃喜甲虫
1) 抗马龄响卷叶病
2) 抗马龄薯甲虫
1) 抗马铬薯 Y病毒
2）抗马龄甲虫
1) 抗马龄 Y 病毒
2) 抗马龄薯甲虫
) 抗与龄募 Y 期毒
2）抗马龄薯甲虫
1) 抗马铃募甲虫
启动子
1) FMV 35S
2) rεbSSU1A
3) P-nos
1) FMV 35S
2) rabSSU1A
3)Pnox
J) FMV 35S
23 ArabsSUIA
3)FMV35S
1) FMV 35S
2) ArabsSU1A
3) P-nog
1) FMV 35S
1 2) ArebSSU1A
[ 3) P-nos
1) FMV35S
2) ArabsSU1A
3>P-nos
1)ArabsSUiA
21 CaMV 35S
结构基因
1) PLRVrep
2) cry 3Aa,
I) PI.RVrep
2) cry 3An.
3)NPTI
1) PLRVrep
2) cry 3Aa.
4) ori-322
)PVYep
2) cty 3Aa,
3) NPTIE
1)PVYep
2) cry 3Aa,
3)NFTI
4) Bdd
5) oriv
6） ori322
1)PVYcp
2) cry 3A2.
3）NPT1
5) oriv
6)ori322
1) cry 3Aa.
SN/T 1198—2003
终止子
2) nos
1) no8
2) nos
3) nos
JYE93#
3) E9 3'
11 F9 3*
2) nos
1) E9 3*
2) nos
3） nog
1)E93+
2) nos
3) nos
PV-STMT21
PV STMT21
PV-STMT22
PV-SMT15
PV-STMT15
PV-STMT15wwW.bzxz.Net
PV-STBT02
SN/T 1198—2003
公司名称及株系
Monsanto公司
NEWLEAF?
ATET 04-06
Mpnento公司
NEWLEAF
ATBT 04-31
Monanto公司
NEWLEAFO
ATBT04-36
Monsanto公司
NEW LEAF
SPBT 02-05
SN/T 1198-2003
改良性状
1）抗马铃馨甲虫
1) 抗马龄甲虫
1) 抗马铃霉甲虫
1) 抗马龄菁甲虫
表 A, 1 (续)
启动子
1) CaMV 35S
2) CaMV 35S
1) ArahsSUIA
2) CeMV 35S
1)AbsSU1A
2) CaMV 35S
1) CaMV 35S
2) CaMV 35S
结构基因
1) cry 3At,
2) NPT11
1) cry 3A,
2) NPTI
I) cry 3A
2) NPT1
3) aad
4) ariy
5)ori322
1) cry 3Ab,
2) NPT
3)oriy
4)o322
续止子
1) E9 3*
2) nos
2) nos
1) F9 3*
2）nog
PV-STBT04
PV-STBT04
PV-STBT04
PV-STBT02
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