本标准规定了抗草甘膦除草剂、抗草丁膦除草剂、雄性不育转基因油菜籽的定性PCR检测方法。本标准适用于抗草甘膦除草剂、抗草丁膦除草剂、雄性不育转基因油菜籽的定性PCR检测。 SN/T 1197-2003 油菜籽中转基因成分定性PCR检测方法 SN/T1197-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net
本标准规定了抗草甘膦除草剂、抗草丁膦除草剂、雄性不育转基因油菜籽的定性PCR检测方法。本标准适用于抗草甘膦除草剂、抗草丁膦除草剂、雄性不育转基因油菜籽的定性PCR检测。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1197—2003
油菜籽中转基因成分定性PCR
检测方法
Protocol of the polymerase chain reaction for detecting geneticallymodified components in rapeseeds2003-03-17发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2003-09-01实施
本标准的附录A是资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提山并归。本标准起草单位，中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：搬良文，沈再飞、陈家华，胡永强。本标准系首次发布的检验检疫行业标准，SN/T1197—2003
「范围
油莱籽中转基因成分定性PCR
检测方法
SN/T 1197-2003
本标准规定了抗草甘麟除草剂,抗草了麟除草剂、雄性不育转基因油菜籽的定性PCR检测方法。本标准适用于抗草甘麟除草剂、抗草丁麟除草剂、雄性不育转基因油浆籽的定性PCR检测。2规范性引用文件
下列文性中的条款通过本标准的引用而做为本标准的条款。凡是性明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容》或性订版均不适用于本标准，然后，鼓励根据本标准达成协议的各方研充是否可使用这些文件的最新版本。从是不汁H期的引用文其最新版本适用于本标准。GB/T6682
分析实验望用水规格和实验方法SN/T1193基因检测实验室技术婴求SN/T 1194:
植物及其产品中转基因成分检抽梯和制样方法SN/T1204植物及其加工产品中转基因成分实时荧光CR定性检验方法3 术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本标准。3.1
转基围 transgene
将物种本身不具有的、来源于其他物种的功能[JNA序列,通过各种导人手段,使其在该物种中进行表达，以便该物种获得新的品种特征。32
聚含酶链式反应polymerase chain reuciion，PCR模板基因序列先经高温变性成为单链,在, DNA 率合酶作用和适宜的这应条件下,根据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的--段比补序列发生退火而相互结合，接着在DNA 亲合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTI)为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性,退火和延这一循环,使被扩增的基因片段以几何倍数扩增。3 3细略语
3. 3. 1 PCR polymerase chain reaction,简称 PCR。3. 3. 2DNArdeoxyribonucleic ncid,脱载核糖核酸。3.3.3dNTP,deaxyrihanucleoside triphosphnte,脱机核苷酸三磷酸。3. 3. 4dATP,deoxyadenosine triphosphate,脱氧腺井 磷.3. 3.5dcTP,deoxycytidine triphosphate,脱氧胞纤三.磷醛。3. 3. 6dGTP,denxyguanosine triphosphate,脱轧鸟 元磷酸。3. 3. 7 d'TTP,deoxythymidine triphosphete,脱氧胞磷酸3.38dUTPdeoxyuridinetriphoaphate，脱氧尿皆=瞬酸。1
SN/T 1197—2003
3, 3. 9UDG, uracil DNA glycosylae,尿噬啶 DNA-糖基酶3. 3. 10bp,bese peir,碱基对.3 3. 11 EDTA,ethylene diatminetetreacetic acid,乙二胺四乙酸.3. 3. 12Tagi Ta DNA Polymetege,耐热 DNA 聚合醇,3. 3. 13TE, Tris-HC1.EDTA 缓冲液,3. 3. 14SDS,sadium dodecylsulfate,十二烷基磺酸钠。3.3.15Tri:tris（hydroxymethyl)aminomethane.三(羟甲基）蒸基甲烷。3, 3. 16PEP, phoaphoenolpyruvate carboxylase gene.碘酸娜醇式丙酸羧化酶。FMV 35S,35S pramoter from modified figwort mosaic virus(caulimavirus graup),玄参花3 3. 17
叶病囊 35S启动子。
基因，
CP4EPSPS，5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegene，5-券草酸-3-爵胶含成3 3. 19 CTP,chloroplast transit peptide gene,叶绿体运输胀基因.3.3. 20GOX，glyphosete axidoreductase gene草甘膦氧化还原酶基因。3 3. 21 E9 3',3' sequence of smnall subunit of rbcS(ribulose-1,5-bisphosphete carboxylage) Eg gene(fram pea),来源于糖互的核酮糖-1,5 二磷酸羧化酵 E9 基因小亚基 3'端序列,3.3.22CaMV35S，35Spromoterfromcauliflowermogaicvirus花棒菜花叶病毒35S启动子。3.3.23PAT,phasphinothricinacetyltransferaseBene fromBacilius amytoliquefaciens，来源于杆业Bacilusamyloliquefacieng草丁膦乙酰转移酶基因，3.3.24BARNASE, ribonuclease gene from Bacillus amyloliquefaciens，来源于杆幽Hacillusamyloliquefaciens 的 ribonucleasc 基因.3 3. 25BARSTAR,specific inhibitor of the barnase gene from Batiflu, unylotiyuefaciens,来源于杆菌Bacillusamyluligufaziens 的barnase基因的特异抑谢基因。3.3.26NPTiI,neomycin-3'-phasphotransferaseBene，新靠家-3'-磷酸转移基因。3. 3. 27NOS.promoter of nopeline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens,来源于农杆菌的胆脂碱合成酶基因自动子。
3. 3. 28NOS 3'+ terminator af nopaline synthase gene,脂碱合成醇基因终止子。3.3.29OCS3',octopine synthase gene terminator，章鱼碱合成酵基因终止子。3. 3. 30 SsuArat ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylese small subunit atalA promoter from Arahi-dapsis thattana,来源于拟南并的 ribulpge-1,5-二磷酸短化醇小亚基 arslA基因的启动于。3. 3. 31 TA29, developmentally regulated promater from anther-specific TA29 gene from Nicotianatabacum,来撤于烟草的花获特异性 TA29 基围的发旁调节肩动子。3. 3. 32 TR7 3',3' regulatory region from Agrubacteriur tumefuciens of the T-DNA transcript 7,来源于农托菌的 T-DNA 转座子 7 的 3'调节区域,4防污缺措炮
检测过程中防止交及污架的措施按照 SN/T 1193 中的规定执行。5抽样和制样
5. 1推样
按瓶 SN/T 1194中规定的方法执行，5. 2制样
称取约20 g油莱籽样品，经干热灭菌(150℃干热预处理2 h)敏120℃、30 min离压消毒处理的磁2
体或粉碎机中碳磨至样品粉求颗粒药0.5mm大小。测定方法
6.1原瑞
SN/T 1197-2003
样品经过提取 DNA后，针对转基因植物所插人的外源基因的基因所列设计引物，通过PR技术，特异性扩增外源基因的 DN A 片断,拟据 ICR 扩增缩果,判断该样品中显否合有转基因成分。6 2 试剂和材料
除另有规楚外，其他试剂为分析纯或生化试剂，水为按朋GB/T6682规定的一一级水。6, 2. 1 1 mnl/I. Tris-HC1 缓冲液(pH 8. 0),称取 121. 1 B,Tris,溶于 80 ml, 水中,搅拌,册人浓盐醛42 ml,,冷却至案温,用帮盐酸难确调整 pH 至 H. 0,分装后高压灭菌备用.6220.5mal/I.EDTA(pH8.0)在800ml.水中加人186.1N2-EDTA·2HU,在磁力搅拌器刷烈搅拌,用氢氧化钠调节落度 pH 值至 8. 0(约需 20 多氢氧化钠显粒) ,然后定容至 1 L,分后高压灭菌备用。
6 2 3 DNA 抽提缓冲液,量取 100 mL. Inol/I. Tris-Cl,5n ml, 0, 5 mol/l. FDTA,称取 5, 0 g SDS,16. 名48 名氯化钠,定容茎1 L,分装后高压灭菌备川]。6 2 4 Tris 饱和酚。
三载甲烷。
6 2 波鼠。
6. 2. 7 异丙醇。
6. 2. 8 70%乙醇,
6 2 9 TE缓冲减(pIH8. 0),量取 10 ml, 1 mol/I, Trus-CI(pH8, 0)和 2 mL 0. 5 mol/1, EDTA(pH8. 0).如水定容至 1 000 mL,分转后高压灭菌备用。6. 2. 10[0X PCR 缓冲液
含 500 nunal/1, 氯化钾, 100 nimol/1, T'r1s-FiCl(p 8. 3),15 mmol/L 氧化镁(MgCl,) ,0, 1%明胶6. 2 11 [0×氟化镁,25 mmol/L。6 2 120XdNTP,含 2. 5 mmol/t dATE,dUTP,dL:rF,dGTP6 2 13 Tag 醇 5 Unit/μl..6 2 14 引物,根据表 1 的序列进行合成引物,如超纯水配制成 100 μmal/], 储存,直接用于 PCR 测试的引物被真为 5 μol/E
表 1 检测转基由油菜籽内外源基因所需的引物序列被该检测基因
CnMV35S
基固来激
引物序列
5'-gctagtxtnsaccuguctig 3\
5'-cactllgteicthicerc-
5'-AEERUliRgIRLLRSTRA-3'
G'-eagggcagiccnnaigangh-3'
5'-gcicctacuaatgct Hit 3
5'-gntogtgngallgigtxirur 3'
scatcsrtEcgataaagHtRA
5'-tcaitcrincgtenigir 3'
扩培长
度/bp
逍火温
筛选检测
解选检测
逸择其一
选择具-
SN/T 1197--2003
性检测因
FMY35S
GOX（您你）
CP4-EPSPS
(警略）
BARNASE
BARSTAR
基因来理
6. 2. 15双蒸水。
引物序殖
裹1(缕）
5'-gaatctgttgccagtcttg-3
5'-ttatcctagtttcacgcte-3\
5'-atcgttcaaacatttggca-3\
5'-ttgcggactctatcata-3\
5'-aggatctcgtcgtgacccat-3*
5'-gcicgamgbazc实tce-3\
5'-ggatetcetgtcitet-3'
5'-g.tcatcctgatcga3
5'-uagcctcaacaggtcag-3'
5'-ctgctcgatgttgacaag-3\
5'-angacatccaccgaxgucttu-3'
5'-eggaoagctcttttccacgtt-3\5-gtcttcgtgttgctgmaccgtt-a\5'-nuactgac是agagcgagage1-3\S'-ctettgttcgtcgtttcatc-a\
5'-gaapcccatccerttgz+gtn-3\5'-gacttgcgtgttcgttcttc-3\
5'-uncaccgttgagcttgagac-3'
S'-cgcggtttgtaatatcgttaao-3\5'-tcttgcaacctctctagatcatca-3\6'-gtcgacatgtetccgtagug-3\
5'-gcaaccaeceaagggtatc-3'
5'-accatcgtcaaccLcticuteg-3\5-gcteccaglancecacgtcat-3
5'-acaagoacgatcancitcc-3
5'-acteggccgtccegtegte-3\
5'-ctggg tggcatcananggg*tcc-3\5'-tccggtectguattctgaagcotg-3'5'-tcagangtatcagcgacctccacc-3'5'-angtatgutggtgatgtcgcigce-3\6.2.16RNaeA.2mg/μL.
. 2. 17
滇化乙锭;10 mg/mL
6. 2. 18 DNA,分手量标记 100 bp~2 000 bp6. 2. 19
琼脏糖。
扩增长
鹿/bp
温火腿
康/℃
蟑选检测
筛遗检测
抗草甘脚
抗草甘爵
抗草甘脾
抗草丁牌
抗草丁腩
抗草于降
及障性不
青油莱
抗草丁脚
及撼性不
膏油燕
抗草期
及换性不
青油莱
抗草丁膦
及雄性不
膏油菜
墟挥其一
选挥其一
选择其一
坳挥其一
些基其一
迪择其一
SN/T 1197—2003wwW.bzxz.Net
6. 2. 20 50 × TAE 缓冲液 称取 484 g Tri9, 量取 114. 2 mL 然Z酸,200 mL 0. 5 mal/L EDTA(pH8.0）.溶于蒸增水巾，定容至2L，分装后高压灭菌备用。6.2.2110×上样缓冲液：含0.25%激酚蓝，0.25%二归苯青FF30%甘油水溶液。6.3收髓
6 3. 1基因扩增仪.
6.3.2电泳仪
6. 3 3电泳槽
6. 3. 毒凝胶分析成像系统。
6.3. 5DNA冷冻于燥离心机，
6. 3 6 玲冻离心机。
6. 3 7 DNA 分析系统,
6.3.8水裕钢。
63.9微披炉。
微置加样器,0. 1 μL~2.5 μL,0. 5 μL~-10 μL,2 μL--20 μL,10 μL~100 μL,20 μL~200 μL,6. 3. 10
200 μL~1 000 μl.s
6. 3. 11犬平感量 0. 001 g
高压灭菌锅。
6.3.13PCR反应管，200μl,500μl.两种规格6. 3. 14Eppendorf 离心管,1, 5 mL。6. 4 检测步腺
6. 4. 1油莱野总 DNA的提取
6. 4. 1. 1 称取约 10 B油染籽样品,在碾钵中加人液氮碾扇至样品粉末颗粒约 0. 5 mm 左右大小,6. 4 1.2称取约40 mg磨碎的样品转入1. 5 mL的Eppendarf管中，设立提取双实验，6.41.3加人100μE.DNA抽挺缓冲液，混勺，注激不要使样品结块，再加人900μLDNA抽提缓冲液,展荡 30 g后,反复显衡混合 5 min.6.4.1.410000离心5min，取上清700μL，加人5μLRNaseA（2mg/mL).37C保温30min.6.4.1.5加人等体积的Tris饱和盼，上下反复期例混勾共10 min。6. 4. 1. 610 000 g 离心 5 min,取上清较 600 μl., 加人等体积的三氮甲烷,_1.下反复颠例滤匀共 5 min.10 000g离心5min，取上清液500μl,加人等体积的异丙游，轻轻混合3min。6. 4. 1. 7
6. 4. 1. B10 000 离心 10 min,此时管底有白色沉避。6. 4. 1. 9 本上清,加人 70%乙醇 1 mL清洗 1 次~-3 次。6. 4. 1. 10 倒去 70%乙醇,短暂高心,用吸管尽可能除去乙醇洗链。低激冷冻干燥约 2 min,加 50 μITE理冲游(pH 8, 0),解 DNA 沉淀.油籽总 DNA的提取也可用相应市售 DNA提取试剂盘提取。6 4. 2PCR 检测
6. 4. 2 1 PCR 反应体系
检测转基因油莱籽中内外測基因来用的 PCR反随体系见表 2。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不间的反应总体积进行适当调整。每个反应体系应设量阴个平行及应，表 2 检测转基因油转内外显基因的 PCR 反应体系试刻名练
10X PCR 埋冲液
氧化快(MgCl,)
险备推教度
25 mmol/L
25μL皮应体系加样体积/uL
50 μl. 反应体系加样体积/ μE5. 0
SN/T 1197—2003
试剂名称
dNTP含 dUTPY
Taa 酶
横板 DNA
双燃水
贮备救披
2. 5 mol/ L
S U/ μL
1u/μl
20 pmal/ μL.
0. 3 μg/ μI,~8 pz/ μL
妻2(续)
25 μL 反皮体系加样体激/ μL2. 5
扑至 25 μ1，
50 μL 反应体高加样悼积/ μl,5.0
至50 l
以转基因油菜籽作为阳性对照,非转基因油菜籽作为阴性对脱，以加人双蒸水作为空白对照,6. 4. 2. 2PCR 皮应情环参数
检测转基因油莱籽内外源基因的 PCR 反应精环参数为：95 C,5 r.in;94C,20 5,引物的退火温40，.72℃.4040个循环，72℃,3mln，非物的退火度见表1，PCR反虑循环参数可根据基因扩增仪型导的不同进行适当调整，
6. 4. 2. 3PCR产物的现脂着凝胶电球检测将适量 50 X TAE稀释成 1× TAE落随+配制液化Z链合体为 0, 5 P4/ tpL 的 2%琼脂糖凝胶,取15=LPCR产物，加1.5μL10×上样缓冲获点样行电脉，并加DNA分于标记点样以判断PCR产物的片段大小，电压大小根据电泳情长度来确定，般控制在3V/cm~5V/cm长度，电述时间根据演酚蓝的移动位量来确定，电减检测结果用既胶分析成像系统记录，6. 5结果判断
6. 5. 1油莱 DA据取症是否通含 PCR 扩增的刺断用针对油莱籽内源参朗基因 PEP基固设计的引物(两对引物可选其--)对油菜籽 DNA 提取微进行PCR测试，阳性对瓶、阳性对服和持测样品部盘敬扩增出248bp或121bp的PCR产物如未见有PCR扩增,则说明在 DNA提取过差中未提取到可进行 PCR 测试的 DNA, DNA 据取液中有抑制PCR 反应的物质存在,应直新据取 DNA,直到扩增出 24B bp 或 121 bp 的 PCR 产物。6. 5. 2袖葬籽中转基成分的检谢对油莱籽样品中转基困成分的检测，可参见附录A的内容，首先筛选检测CaMV35S.FMV35S、NOS,NPTII 基因,
如果 CaMV 35S,NOS,NPTI、FMV 35S基因的检测结果均为阴性,则直接报告检测结果如果CaMV35S、NOS,NPTI、FMV35S基因的检测给巢有.个取两个成阴性蜡果，刚应进-步检测外翻目的基因GOX(怖）、CP4-EPSPS(能怖>、BAR、PAT、BARNASE、BARSTAR中的一个戒几个基因于以确认为哪一性状的转基因袖菜籽，对于HCR捡测结果为阳性的样品，应进一步进行确证试验，裁后报告检测结果。
6. 6确证试险
确正试验方按照 SN/T 1204 中期定的方按热行?增号衰燃
性缩果
经用 PCR 方祛对油染籽代表性样品进行检测,末检出× × × ×基因。7.2阳性情果
经用PCR方法对油菜籽代表性样品进行检测，检出×X××X基函，5
公司名称
Mnabatto
AgtEva
Genetic
Systems
附染A
（资料性附录)
转基因油满转入的外谢基因的有关信惠转基因油莱转入的外道基因的有关首息囊A. 1
改良性状
抗草甘牌
抗草了膜
启动子
1) FMV 35S
2) FMV 35S
1) CnMV 35S
2) NOS
1) TA20
雄性不育抗草！
2) TA29
3)ShuAra
结构基因
SN/T1197——2003
蜂止子
CP4 HPSPS((with CTP2)
()X(修饰)(wIh eTPI)
HARNASE
HARSTAR
BAR(With CTP)
CaMV35s
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